文档介绍：Chapter11. Gene manipulation
1. 分子生物学相关技术
Gel Electrophoresis
分子杂交和印渍技术
PCR技术
DNA sequencing
、Gel Elecic acid.
Uniform labeling: require polymerases（聚合酶） to synthesize a complete labeled strand.
5’-末端标记:可用多核苷酸激酶将具放射活性的磷酸加到具有游离5 ’ －OH的核酸上。游离的5 ’ OH可由碱性磷酸酶去磷酸化产生。ATP的γ-磷酸是用来标记的标记源。
3’-末端标记:可用末端转移酶向核酸的3’端加上一个或多个核苷酸进行。
均匀标记：需用聚合酶完成一条完整的被标记链。
印迹技术的类别及应用
DNA印迹技术 Southern blotting
RNA印迹技术 Northern blotting
蛋白质印迹技术 Western blotting
斑点印迹 Dot blotting
原位杂交 in situ hybridization
DNA点阵 DNA array
DNA芯片技术 DNA chip
Southern blotting DNA印迹技术
又称Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。主要用于基因组DNA的分析，
Paper Towels
DNA的制备
限制性酶切
琼脂糖凝胶电泳
Northern blotting RNA印迹技术
又称Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。
用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。
主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。
Western blotting 蛋白质印迹技术
又称Western杂交，或免疫印迹技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到***纤维素膜上的特异性蛋白质。
应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
三种印迹技术的比较
聚合酶链式反应
Mullis K. 1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。
The Nobel Prize in Chemistry 1993
、PCR (polymerase chain reaction)
模拟DNA在体内的复制过程，利用与模板两端互补的一对寡聚核苷酸引物来扩增一段DNA序列。
在模板DNA、引物、4种dNTP存在条件下，依赖DNA 聚合酶催化一对引物间特异DN***段合成的体外扩增技术。
PCR定义：
5
Primer 1
5
Primer 2
Cycle 2
Cycle 1
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Template DNA
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一、基本工作原理
Cycle 3
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25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。
PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸
72˚C
退火
Tm-5˚C
模板DNA
特异性引物
耐热DNA聚合酶
dNTPs
Mg2+
PCR体系基本组成成分
Template
Primers
Tm=2(A+T)+4(G+C)， primer﹤25nt. 退火温度≈ Tm±5℃
几乎所有的DNA原则上都能用作PCR的模板。
PCR引物需18~30nt，并且引物对间的G+C含量相似40-60％
Annealing temperature
扩增终产物大小
介于两条退火引物5′末端之间的双链DN***段。
PCR thermal cycler
Rotor-Gene
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
5′ AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCA