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第十一章基因操作.ppt

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文档介绍:Chapter11. Gene manipulation



1. 分子生物学相关技术
Gel Electrophoresis
分子杂交和印渍技术
PCR技术
DNA sequencing



1.1、Gel Elecic acid.
Uniform labeling: require polymerases(聚合酶) to synthesize a complete labeled strand.
5’-末端标记:可用多核苷酸激酶将具放射活性的磷酸加到具有游离5 ’ -OH的核酸上。游离的5 ’ OH可由碱性磷酸酶去磷酸化产生。ATP的γ-磷酸是用来标记的标记源。
3’-末端标记:可用末端转移酶向核酸的3’端加上一个或多个核苷酸进行。
均匀标记:需用聚合酶完成一条完整的被标记链。


印迹技术的类别及应用
DNA印迹技术 Southern blotting
RNA印迹技术 Northern blotting
蛋白质印迹技术 Western blotting
斑点印迹 Dot blotting
原位杂交 in situ hybridization
DNA点阵 DNA array
DNA芯片技术 DNA chip


1.2.1 Southern blotting DNA印迹技术
又称Southern杂交,即DNA-DNA杂交分析。主要用于基因组DNA的分析,
Paper Towels


DNA的制备
限制性酶切
琼脂糖凝胶电泳


1.2.2 Northern blotting RNA印迹技术
又称Northern杂交,即RNA-DNA杂交分析。
用DNA(或RNA)探针检测RNA样品。
主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。


1.2.3 Western blotting 蛋白质印迹技术
又称Western杂交,或免疫印迹技术,即利用抗原-抗体反应,检测转移到***纤维素膜上的特异性蛋白质。
应用:用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。


三种印迹技术的比较




聚合酶链式反应
Mullis K. 1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。
The Nobel Prize in Chemistry 1993
1.3、PCR (polymerase chain reaction)



模拟DNA在体内的复制过程,利用与模板两端互补的一对寡聚核苷酸引物来扩增一段DNA序列。
在模板DNA、引物、4种dNTP存在条件下,依赖DNA 聚合酶催化一对引物间特异DN***段合成的体外扩增技术。
PCR定义:


5
Primer 1
5
Primer 2
Cycle 2
Cycle 1
5
5
5
5
5
5
Template DNA
5
5
5
5
5
5
5
5
一、基本工作原理


Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
25~30 次循环后,模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。


PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸
72˚C
退火
Tm-5˚C



模板DNA
特异性引物
耐热DNA聚合酶
dNTPs
Mg2+
PCR体系基本组成成分


Template
Primers
Tm=2(A+T)+4(G+C), primer﹤25nt. 退火温度≈ Tm±5℃
几乎所有的DNA原则上都能用作PCR的模板。
PCR引物需18~30nt,并且引物对间的G+C含量相似40-60%
Annealing temperature
扩增终产物大小
介于两条退火引物5′末端之间的双链DN***段。


PCR thermal cycler
Rotor-Gene


PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析


5′ AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCA

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上传人:zxwziyou9 2022/6/22 文件大小:8.26 MB

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