文档介绍：第十六章 转基因技术与作物育种
Plant Transformation
Plant transformation is the introduction of alien genes into the geno基酸序列的特点发展的一条快捷克隆即因家族未知成员的新途径，即基于同源序列的候选基因法。
表达序列标签是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包含了该基因足够的信息区，因而可以和其他基因相区分。目前，表达序列标签主要是通过cDNA的途径获得。
（2）根据连锁图谱克隆的基因
精确定位的大片段
DNA文库
连锁的分子标记筛选
含目的基因的大片
段DNA克隆
含目的基因的精细
物理图
染色体步行
分段制成探针
cDNA文库
目的基因
亚克隆文库
含目的基因
的亚克隆
序列分析及
基因克隆
目的基因的图位克隆方法示意图
（3）转座子标签法
转座子是染色体上一段可复制、移动的DN***断，复制的拷贝可以从一个位置跳到另一个位置。
纯合体突变株
核基因库1
带转座子DN***断
野生型植株
核基因库2
完整的目的基因
互补测验
检测功能
转座子探针
亚克隆片断做探针
转座子标签法克隆重要农艺性状基因示意图
（4）差异显示法
在生物个体发育的不同阶段或是在不同的组织、空间进行有序表达的方式，叫做基因的差异表达。
差异显示PCR是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带，该条代就有可能是全长或是部分特异表达的基因，利用这种方法进行基因克隆的方式就是差异显示法基因克隆。
现在又出现了限制性消减杂交（SSH）和RNA任意引物PCR（RAD-PCR）等多种方法。
１通过ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ
２从基因组文库中获取目的基因
分离基因的途径
２ 从原核生物中获取目的基因载体并进行改造
３用限制性内切酶将载体切开,用连接酶把目的基因连接到载体上，获得ＤＮＡ重组体
（二）目的基因重组质粒的构建
质粒重组的基本步骤：
从原核生物中获取目的基因的载体并进行改造；
利用限制性内切核酸酶将载体切开，并用连接酶把目的基因连接到载体上，获得DNA重组体。
４以欲改造的植物为受体，使重组ＤＮＡ进入受体细胞，即实现外源ＤＮＡ的转化
（三）受体材料的选择
（1）良好的植物基因转化系统应具有的条件：
高校稳定的再生能力；
受体材料要有较高的遗传能力；
具有稳定的外植体来源；
对筛选剂敏感。
（2）常用受体材料的类型：
愈伤组织再生系统
直接分化再生系统
原生质体再生系统
胚状体再生系统
生殖细胞再生系统
（四）转基因方法的确定和外源基因的转化
将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体携带将外源基因导入植物细胞并整合在核染色体组中随着核染色体组一起复制和表达。
主要方法有：
叶盘法
真空渗入法
原生质体共培养法
这是一种不需要借助载体介导，直接利用理化因素进行外援遗传物质转移的方法。
主要方法有：
化学刺激法
基因枪轰击法(gene gun )
高压电穿孔法(electroporation)
微注射法(microfibers )
超声波介导法
脉冲电泳法
离子束介导法
microscopic gold particles
plant cells
５被转化的受体细胞再分化生成完整植株，外源ＤＮＡ在受体内表达
（五）转化体的筛选和鉴定
（1）DNA水平的鉴定
（2）转录水平的鉴定
（3）翻译水平的鉴定
转化体的鉴定
1 标记基因
2 Southern杂交或PCR扩增
转基因植株中CryIAc基因的PCR检测
PCR analysis of CryIAc in putative transgenic plantlets
转基因植株中CryIAc基因的Southern鉴定
Southern assay of CryIAc in putative transgenic plants
3 Northern杂交
1x 5x
Event
1
1
2
3
4
2
3
4
4 Wertern杂交或蛋白质分析