文档介绍：煎为年阈师3如号陇
/ 『U y di IL H - III Id 1 j U11 . c
2011届本科毕业论文（设计）
SDS-聚丙烯酰***'凝电冰染色万
法的改进
学院生命科学学院
专业生物科学
学号 2007。考马斯亮蓝G-250是快染，能与蛋白质迅速进行结合反应，约2 min即可达到平衡；它们的结合物在室温下1 h内保持稳定。一般情况下传统考马斯亮蓝染色法染脱时间较长，约 6 ~24 h[2],同时在多次漂洗、换液的过程中，凝胶表面容易被污染⑶，而且凝胶中的SDS会干扰考马斯亮蓝和蛋白质的结合，使染色效果受到影响。同时常染所用的甲醇易挥发，在人体代谢作用下会转化为甲酸，进而在人眼睛部位积累，对视神经细胞进行破坏，危害操作者健康囹。
本文采用考马斯亮蓝G-250进行染色，通过水浴和微波热处理法，对传统的考马斯亮蓝染色法进行改进，以期达到大大缩短凝胶染色、脱色时间，从而使操作更简便，所用试剂更少，成本更低，更有利于操作者的健康的目的。
材料与方法
1. 1实验材料

浓硫酸，甘油，筑基乙醇，N,N,N,N 一四***乙二***（TEMED）,浓缩胶缓冲液（1M的Tris-HClpH ）,无水乙醇，冰乙酸，双蒸水，牛血清白蛋白（68 kb）, 考马斯亮蓝G-250,丙烯酰***，N,N-甲叉双丙烯酰***，漠酚蓝，十二烷基磺酸钠（SDS）,甘氨酸，Tris碱，过硫酸***。
、设备
直流稳压电源，水平脱色摇床（太仓科技器材厂），移液枪，垂直电泳槽，凝胶成像分析仪（金西盟北京仪器有限公司），pH计，量筒，烧杯，容量瓶，电子天平（奥豪斯仪器上海公司），低温冰箱（合肥美菱有限公司），双蒸水蒸馅器，灌胶支架，电磁炉（九阳股份有限公司），水浴锅，微波炉等。

30 %的丙烯酰***
用电子天平分别称取丙烯酰***, N,N—亚***双丙烯酰***,用60 mL热的双蒸水溶解，过滤，定容到100 mLo （由于未聚合的丙烯酰***和甲叉双丙烯酰***具有神经毒性，操作均须戴口罩手套，并在通风处进行，保存于棕色瓶中，4 °C存放。）
10%十二烷基硫酸钠（SDS）
用电子天平称取10 gSDS粉末，于90 mL双蒸水中加热至68 °C溶解，定容至
100 mL,室温保存。
10%过硫酸***（AP）
g过硫酸铉于5 mL双蒸水中溶解，4°C保存（需新鲜配制）。
分离胶缓冲液（-）
gTris粉末，于80 mL双蒸水中溶解，pH计测量并用浓 ,后定容至100 mL, 4 °C保存。
Tris-甘氨酸5 X电泳缓冲液
g甘氨酸，用900 mL双蒸水溶解，再加入1 gSDS,用容量瓶定容至1000 mLo

lMTris-，5 mL 50%的甘油，2 mL 10 % 的SDS, mL筑基乙醇，1 mL 1 %漠酚蓝， mL双蒸水，混合，4°C保存待用。
g的牛血清白蛋白，于100 mL双蒸水中溶解，即为1000|ig/mL的蛋白质原液。

。
表1 SDS-PAGE凝胶的有效分离范围
丙烯酰***浓
度（%） 15 10

蛋白质线性
分离范围 15-435 15-60 18-75 30-120
(kDa)
60-212
由于实验所用标准蛋白的分子量为68 kb,并结合其他文献综合考虑应选择浓度为10 %的分离胶。先用洗涤剂分别把玻璃板，样品梳，Space洗净，双蒸水冲洗几次，吹风机吹干。把Space安装到制胶架上，按要求用制胶模安装并固定好玻璃板（两边均匀用力），插入梳子后，在距齿底约1cm的地方用记号笔做个标记，去除加样梳，以有利于目测分离胶灌制的大致位置。
ml 10 %的分离胶。
表2分离胶的配制比
双蒸水
1 MTris-HCl
pH
液
30% Acr-Bis
10%
SDS
10%
AP
10%
TEMED
mL
mL
mL
80 |1L
56 |1L
6(1L
TEMED为加速剂应最后加入，烧杯中迅速混合均匀后，向玻璃板间一次性缓缓灌制分离胶到标记处，并立即沿玻璃壁来回移动注入一层双蒸水，水封，以排空气口。约