文档介绍：生物技术制药-07
第七章酶工程制药
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第七章酶工程制药
第一节概述
第二节酶的来源和生产
第三节酶和细胞的固定化
第四节固定化酶和固定化细胞的反应器
第五节酶工程在医药工业中的应用
第六节酶工
由于酶的空间结构、活性位点等物理化学特性不同，因此并不是一种固定化技术就能普遍适用于每一种酶，所以要根据酶的应用目的和特性，来选择其固定化方法。
目前已建立的各种各样的固定化方法，按所用的载体和操作方法的差异，一般可分为载体结合法、包埋法及交联法3类，细胞固定化还有选择性热变性（热处理）方法。
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酶和细胞的固定化方法
载体结合法
交联法
包埋法
热处理（细胞）
物理吸附法
共价结合法
网格型
微囊型
离子结合法
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（1）载体结合法
载体结合法是将酶结合于不溶性载体上的一种固定化方法。
①物理吸附法：是用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的一种固定化方法，此类载体有无机载体、天然高分子、大孔型合成树脂、疏水型的载体。物理吸附法的缺点在于最适吸附酶量无规律可循，不同载体和不同酶其吸附条件也不同，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，同时酶与载体之间的结合力不强，酶易于脱落，导致酶活力下降并污染产物。此法也可固定细胞；
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（1）载体结合法
②离子结合法：是通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上的固定化方法。此类载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂，如DEAE-纤维素、Amberlite CG-50、XE-97、IR-45和Dowex-50等。操作简单、酶的高级结构和活性中心的氨基酸不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。但是载体与酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或vpH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，往往会发生酶从载体上脱落的现象。此法也可用于微生物细胞的固定化，细胞有自溶现象。
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（1）载体结合法
③共价结合法：
共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定化方法，也就是将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。它是研究最广泛、内容最丰富的固定化方法，其原理是酶分子上的功能团，如氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基等和载体表面的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在载体上。
共价结合法有数十种，如重氮化、迭氮化、酸酐活化法、酰氯法、异硫氰酸酯法、缩合剂法、溴化氰活化法、烷基化及硅烷化法等。
在共价结合法中必须首先使载体活化，即使载体获得能与酶分子的某一特定基团发生特异反应的活泼基团；另外要考虑到酶蛋白上提供共价结合的功能团不影响酶的活性；反应条件尽可能温和。
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共价结合法的优缺点
共价结合法与离子结合法和物理吸附法相比，反应条件苛刻，操作复杂，而且由于采用了比较强烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构的变化，破坏部分活性中心，因此往往不能得到比活性高的固定化酶，甚至酶的底物专一性等性质也会发生变化。但是酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。
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（2）交联法
交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。交联法有可分为交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法及载体交联法4种。其内容有酶分子交联、分子间交联或辅助蛋白与酶分子间交联；也可以先将酶或细胞吸附于载体表面而后再交联或者在酶与载体之间进行交联。常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2,2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯及己二酰亚胺二甲酯等。参与交联反应的酶蛋白的功能团有N-末端的- 氨基、赖氨酸的-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基及组氨酸的咪唑基等。
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交联法的优缺点
交联法的反应条件比较强烈，固定化酶的酶活回收一般较低，但是尽可能降低交联剂的浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。
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最常用的交联剂是戊二醛，它的二个醛基与酶分子的游离氨基反应形成schiff碱，彼此交联，其方式如下：
—CH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CH-
交联方式
N
CH
(CH2)3
CH
N
N
CH
(CH2)3
CH
N
—CH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CH-
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交联法
一般用交联法所得到的固定化酶颗粒小，结构性能差、酶活性低，故常与吸附法或包埋法联合使用。如先使用明胶（蛋白质）包埋，再用戊二醛交联；或先用尼龙（聚酰胺类）膜或活性炭、Fe2O3等吸附后，再交联。由于酶的功能团，如氨基、酚基、羧基、巯基等参与了反应，会引起酶活性中心结构的改变，导致酶活性下降。为了避免和减少这种影响，常在被交