文档介绍：基于焦平面估计的快速扫片方法
卢祎 张雪媛 何勇军 摘 要:随着仪器自动化的发展,基于显微镜的自动阅片系统被广泛应用于医学领域。该系统需要在显微镜视野下移动多个位置并拍摄标本图像,以完成整个扫描任务。但是由于载物台平面与物镜中轴节,一是清晰度评价函数,用于评价图像的清晰程度;二是聚焦搜索策略,是寻找焦点的方法。典型的清晰度评价函数有低灰度值统计法[1]、基于边缘检测[2-4]、灰度值差分绝对值之和算子[5-6]、拉普拉斯算子[7]、Roberts梯度算子[8-9]等。焦点搜索方法有遍历搜索法[10]和变步爬山法[1]。目前扫片效果较好的聚焦策略是使用有三种步长的变步爬山。先计算当前视野的清晰度评价函数值,根据所得函数值判断离焦状态,离焦严重、轻度和微小分别对应变步爬山的大步长、中步长和小步长。使用离焦状态对应的步长在垂直载玻片的方向上移动物镜,每移动一个步长计算一次评价函数值,更新离焦状态,多次探测,取清晰度最大的位置既是当前视野的焦点,采集图像。由于变步爬山法在扫片过程中会多次移动,甚至会出现探测焦点的死循环,扫描效率低下。
显微镜的载物平台具有一定精度,相邻视野的焦点位置存在一定的依赖关系,比如处于同一个平面但与镜头中轴线不垂直。因此,当样本玻片放在显微镜下时,只要可以确定这个平面和显微镜观察角度的关系就可以确定相邻视野的焦平面。扫描某一个视野时,首先通过估计出的焦平面计算出该视野的焦点位置,然后直接移动到焦点位置实现聚焦操作,无需多次移动去试探性地搜索焦点,就可以在最大程度的提升自动阅片的效率。基于此,本文利用三点确定一个平面的方式粗略估计焦平面,判断研究方向的正确性。首先采集3个不在一条直线上的点自动聚焦,再取这3个点的坐标,这3个点可以确定的三维平面作为估计的焦点平面。但在应用中,除了平台误差外,还有样本的被观察表面可能存在起伏,单个平面对焦平面的刻画不够精细。因此,本文进一步提出了一种基于多点聚焦的快速采集方法。该方法是将样本扫描区域细分为多个区域,认为每个三角区域范围内的焦点落在对应的三角区域所在的平面上。实验中使用低灰度值统计法、灰度值差分绝对值之和算子和拉普拉斯算子清晰度评价函数对采集图片进行清晰度评价。实验结果表明,三点聚焦可以在保持清晰度情况下有效提高扫描效率,而多点聚焦方法比三点聚焦在清晰度提升方面具有更好的性能,实现牺牲较小清晰度的前提下,提高扫片效率。 1 三点聚焦快速扫片方法
标准的三维平面重建,都是采用3个点建立平面。在显微镜下找到3个不在同一直线上的3个点,利用自动聚焦技术,获取到每个位置的焦点坐标。已知3个已知点的坐标P(x0,y0,z0)、Q(x1,y1,z1)、U(x2,y2,z2),如图1所示,可得两个相交的空间向量PQ、PU,利用这两个向量可以求得垂直于这三个点所确定平面的法线向量,如式(1),求得n=(A,B,C),利用点法式计算得到平面方程(2)。
三点聚焦的快速扫片流程如图2所示,将组织样本玻片放置在显微镜下,首先在样本上找到3个不在一条线上的3个点,分别聚焦获得每个点的X轴、Y轴和Z轴坐标,然后通过这3个点计算其所在平面。接下来开始扫片,将平台移动到下一个采集图像的位置,通过该位置的X轴和Y轴坐标计算对应的Z轴坐标,移动Z轴到指定位置,最后采集图像,直到采集的数量满足要求,结束扫片。
2 多点聚焦快速扫片方法
三点聚焦的方法,能有效解决整个平台的倾斜问题,但缺无法解决平台加工的误差问题和被观察样本表面起伏问题。因为三点聚焦的方法对聚焦曲面的刻画不够精细,而且对3个点的精度要求非常高,当任意一个点的焦点位置聚焦精度不够时,所建立的平面与真实平面会出现差异,且在三角形外部距离3个点越远的位置,其偏差距离越大,导致图像模糊。
多点聚焦快速扫片方法,是在3个点建立平面的基础上,增加了多个三角形平面,并减小了每个三角形的面积,这样做更加精细划分被观测平面,可以应对较复杂的观测表面。多点聚焦快速扫片流程如图3所示,将组织样本玻片放置在显微镜下,首先在样本上按照一定方式找到多个位置,分别聚焦获得每个位置的X轴、Y轴和Z轴坐标,通过指定的分割方法将样本分割成多个三角区域,并确定每个三角区域的平面公式。将平台移动到下一个采集图像的位置,通过该位置的X轴和Y轴坐标,判断该位置所在的三角形区域,根据该区域对应的平面公式,计算对应的Z轴坐标,移动Z轴到指定位置,最后采集图像,直到采集的数量满足要求,结束扫片。
2-1 多点平面分割方法
由于样本涂层的形状一般都是一个近似圆,所以建立坐标系的原点采用组织样本的中心点,取样点如图4所示,图中圆圈对应组织涂层的位置,在圆内均匀的选择14个点,这14个点要尽可能覆盖载玻片的各