文档介绍：PCR基因扩增
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一、实验目的
通过本实验学****PCR反应的基本原理与实验技术
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二、实验原理
PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法，
包括DDT）或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA），它们可稳定酶活性
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2、PCR反应参数
变性
退火
延伸
循环次数
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变性
变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的 DNA双链会很快复性，减少DNA产量
一般变性温度与时间为94℃ 1 min。在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。
对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失
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退火
引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度
实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高
有些反应可将退火与延伸两步合并，只用两种温度（如用60℃和94℃）完成整个扩增循环，既省时间又提高了特异性
退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37℃～55℃，1-2min
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延伸
延伸反应温度通常为72℃，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃
Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃～85℃，引物延伸在退火时即已开始
延伸时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。一般反应 体系中，Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间
扩增反应完成后，都需要一步较长时间（10～30min）的延伸反应，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要
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循环次数
当其它参数确定之后，循环次数主要取决于DNA浓度
一般而言25～30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加
通常25～30轮循环扩增后，反应中Taq DNA聚合酶已经不足，如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释103～105倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60轮循环后，扩增水平可达109～1010
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5’
3’
5’
3’
Double stranded
DNA template
Region to be amplified
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5’
3’
5’
3’
Design primers with
this sequence information
Identical to
this sequence
Reverse complement of this sequence
Double stranded
DNA template
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5’
3’
5’
3’
PCR Cycle 1
Primers
Taq
Taq
Double stranded
DNA template
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5’
5’
3’
3’
PCR Cycle 1
Denaturation
95 ℃
strands separate
Primers
Taq
Taq
Taq polymerase is thermostable
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3’
5’
5’
3’
Annealing
~55 ℃ Primers bind
Taq
Taq
Forward primer anneals to lower strand
Reverse primer anneals to upper strand
PCR Cycle 1
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3’
5’
5’
3’
Annealing
~55 ℃
Taq binds
Taq
Taq
PCR Cycle 1
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3’
5’
5’
3’
Extension
72 ℃
Taq copies DNA strand dNTPs
Taq
Taq
Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction
PCR Cycle 1
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3’
5’
5’
3’
Taq
Taq
Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction
PCR Cyc