文档介绍：1 重组人胸腺素β4 基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测【摘要】目的: 利用基因工程的方法原核表达重组人胸腺素β 4(T β 4) 并对其进行纯化和鉴定. 方法: 使用大肠杆菌偏爱密码子合*** Tβ4 全长基因, 构建了 Tβ4 的二串联体基因(Tβ4②), 将其克隆入表达载体 pET 拟 22b(+) 中, 重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态,IPTG 诱导表达后, 经盐析、疏水层析和离子交换层析纯化重组蛋白, 采用免疫印迹和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对重组蛋白进行鉴定. 结果: 获得了纯化的重组 Tβ4②蛋白, 并具有生物学活性. 结论:成功构建、表达和纯化了 Tβ4②, 为其功能研究奠定基础. 【关键词】胸腺素β4 串联重复序列克隆分子基因表达 0 引言胸腺素β 4(thymosin beta 4,Tβ 4) 广泛分布于各组织、器官和细胞中, 与免疫功能、神经发育和肌动蛋白功能密切, 还可抗炎, 促进血管生成[1]、创伤愈合[2]、毛囊发育[3], 修复 2 受损的心肌[ 4]. 虽然 Tβ4 有着广泛的应用前景, 但由于其分子太小,难于直接在大肠杆菌中表达. 目前用于实验室及临床试验的 Tβ4 主要为化学合成品, 价格昂贵, 使其应用受到限制. 我们利用基因合成与 PCR 技术, 构建了 Tβ4 的二串联体基因( Tβ4②)表达载体, 在大肠杆菌中成功地表达和纯化了该串联体, 为进一步的研究奠定了基础. 1 材料和方法 材料质粒 pET 拟 22b(+) ,大肠杆菌 DH5 α及 BL21(DE3) 由本中心保存;人Tβ4 全长基因、测序( 北京奥科生物技术有限责任公司); 引物( 上海英峻生物公司); 限制性内切酶 Nde Ⅰ, BamH Ⅰ, Sal Ⅰ,T4 DNA 连接酶以及 DNA Marker DL2000(TaKaRa);Taq PCR Mix( 天根生化科技有限公司);B 型质粒小量提取试剂盒, 小分子量 DNA 片段高效快速回收试剂盒( 北京博大泰克生物基因技术有限责任公司); 蛋白分子质量标准(Fermentas); 兔抗人 Tβ4 多克隆抗体(Abcam,ab14334);HRP 拟山羊抗兔 IgG,DAB 显色液( 北京中杉金桥生物技术有限公司);IPTG, 琼脂, 琼脂糖,MTT( 北京鼎国生物技术有限责任公司); Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub), Q Sepharose Fast Flow, KTA Purifier(Pharmacia);ConA( 华美生物工程公司), 小鼠淋巴细胞 3 分离液( 天津灏洋生物制品科技有限责任公司), 胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司), RPMI1640(Gibco), Tβ4化学合成品(ProSpec 拟 Tany), 其他试剂均为国产分析纯;BALB/ c 小鼠, 雄性,6~ 8 周龄( 第四军医大学实验动物中心). 方法 重组 Tβ4②基因的克隆按照大肠杆菌惯用密码子及人胸腺素β4 氨基酸序列设计并合成了编码 Tβ4 的全基因片段,5′和3′末端分别带有 Nde Ⅰ和 BamH Ⅰ酶切位点, 将其克隆入 pET 拟 22b(+) 中, Nde Ⅰ和 BamH Ⅰ双酶切鉴定后, 将其命名为 pET 拟 22b(+) 拟Tβ4①; 合成两条引物, 上游引入 BamH Ⅰ酶切位点, 下游引入 Sal Ⅰ酶切位点及终止密码子 TAG, 以 pET 拟 22b(+) 拟Tβ4①为模板进行 PC R 扩增,PC R 产物经 BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ双酶切后克隆入 pET 拟 22b(+) 拟Tβ4①中, BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ双酶切鉴定并测序, 命名为 pET 拟 22b(+) 拟Tβ4②. . 2重组Tβ4②的表达重组质粒 pET 拟 22b(+) 拟Tβ4②转化大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细胞, 挑取阳性克隆接种于含氨苄青霉素 100 mg/L 的 LB 培养液中,37 ℃震荡培养过夜,(a) 以 1∶ 100 分别转接入六个试管中, 继续培养 2 h(A600 nm=) 后, 其中一管作为诱导的阴性对照, 另五管分别加入终浓度为 4 ,,,,1 mmol/L IPTG, 继续培养 4 h, 离心收集菌体行 SDS 拟 PAGE;(b) 以1∶ 100 分别转接入两个试管中, 继续培养2 h(A600 nm=) 后, 其中一管作为诱导的阴性对照, 另一管加入终浓度为 mmol/L IPTG, 每隔 1h 收集菌体进行 SDS 拟 PAGE. . 3重组Tβ4②的 Weste