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文档介绍：SDS-PAGE 蛋白电泳手册蛋白电泳手册 SDS-PAGE 及 Western blot 蛋白电泳蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一, 电泳是指带电粒子在电场作用下, 向着与其电荷相反的电极移动的现象. 根据所采用的支持物不同, 有琼脂糖凝胶电泳, 淀粉凝胶电泳, 聚丙烯酰***凝胶电泳等。其中, 聚丙烯酰***凝胶电泳(PAGE) 由于无电渗作用, 样品用量少(1-100 μ g) ,分辨率高, 凝胶机械强度大, 重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用。 PA GE 原理聚丙烯酰***凝胶是由丙烯酰***( 简称 Acr) 和交联剂 N,N ’—亚***双丙烯酰***( 简称 Bis ) 在催化剂作用下, 聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰***凝胶电泳( PAGE )可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。 SDS-PAGE 原理 SDS 是一种阴离子表面活性剂,能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物, 使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷, 掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此, 各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率,不再受原有电荷和分子形状的影响, 而只是棒长的函数。这种电泳方法称为 SDS- 聚丙烯酰***凝胶电泳(简称 SDS — PAGE )。实验使用过程中, 还加入 DTT 或者*** , 以打开蛋白间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构。 SDS — PAGE 最常采用垂直板不连续系统(分离胶与浓缩胶)。索引蛋白电泳( SDS-PAGE ) ……………………电泳试剂总表……………………………………………………制胶………………………………上样及电泳……………………染色蛋白提取蛋白定量 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒使用说明 BCA 蛋白浓度测定试剂盒使用说明 Lowry 蛋白浓度测定试剂盒使用说明蛋白分子量标准(图) 考马斯蛋白胶快速染色液 Western blot Western blotting DAB 检测试剂盒 Western blotting ECL 化学发光检测试剂盒 Western blotting 试剂盒使用说明蛋白电泳试剂(部分试剂可以相互替换) 系号货号名称 1 T8060 TRIS 三羟***氨基甲烷 2 G8200 Glycine 甘氨酸 3 S8010 SDS 十二烷基硫酸钠 4 A8080 Acrylamide 丙烯酰*** 5 M8200 N,N-Methylene Bisacrylamide 甲叉双丙烯酰*** 6 A8090 Ammon ium Persulfate 过硫酸*** 7 D8220 DTT 二硫苏糖醇 8 M8210 β-Mercaptoethanol β-*** 9 T8090 TEMED 四****** 10 A1010 30% 丙烯酰***( 29:1 ) 11 S1051 4XSDS-PAGE 分离胶缓冲液( PH= ) 12 S1052 4XSDS-PAGE 浓缩胶缓冲液( PH= ) 13 P1016 4× 蛋白上样缓冲液(含β-***) 14 P1015 4× 蛋白上样缓冲液(含 DTT) 15 D1070 1M DTT 16 A1030 10% 过硫酸氨 17 T1020 1M Tris-HCL () 18 T1010 Tris-HCL() 19 S1010 10%SDS 20 T1070 5× Tris- 甘氨酸电泳缓冲液 SDS-PAGE 如今已形成成熟的方案, 实验室可根据自己的情况和****惯来选择试剂。如选择 1、2、3、4、5、6、7、8、9 全部试剂可自己配制。也可以选择配制好的试剂。如 10、 11、 12、 13/14 、 16、9、 20 。还可选择 10、 13/14 、 16、9、 17、 18、 19、 20。一,制胶凝胶配制表(一) 分离胶 12% 分离胶 10% 分离胶 8% 浓缩胶( 3% ) 总体积 10ml 10ml 10ml 5ml 4X 分离胶缓冲液( ) 4X 浓缩胶缓冲液( ) 30% 丙烯酰***(29:1) 4ml ddH2O 10% 过硫酸铵 100ul 100ul 100ul 75ul TEMED 10ul 10ul 10ul 凝胶配制表(二) 分离胶 12% 分离胶 10% 分离胶 8% 浓缩胶( 3% ) 总体积 10ml 10ml 10ml 5ml 30