文档介绍：实验六肝糖原的提取(生物化学实验操作考核卷) 姓名, 学号, 专业,级班组, 月日目的要求: 1. 掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。 2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。 3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4. 熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况,采用合适的混匀方法)。 5. 正确掌握溶液转移的操作。 6. 正确操作使用分光光度计。实验原理: (一)肝糖原的提取、鉴定糖原储存于细胞内, 采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎, 低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性, 破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质, 而糖原仍稳定地保存于上清液中, 从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水, 故先用 95 %乙醇将滤液中糖原沉淀, 再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽, 遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中, 依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖, 利用呈色反应和葡萄糖的还原性, 可判定肝组织中糖原的存在。 CuSO4 十 2NaOH ═ Na2 SO4+Cu(OH)2 ↓ 2Cu(OH)2 十 C6H12O6 ═ 2CuOH 十氧化型葡萄糖+H2O 2CuOH ═ Cu2O ↓( 红色)+H2O Cu(OH) CuO ↓( 黑色)+H2O (二)肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖, 浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物—— 5- 羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在 620nm 处有最大吸收。糖含量在(10?100)?g 范围内, 溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色, 通过标准对照法( 直接比较法) 即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定, 故在显色之前, 肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其它成分,而保留肝糖原。实验材料: (一)仪器 1. 普通离心机,室温?100 ℃恒温水浴箱( ×2), 722 型分光光度计, 精度为 10mg 级电子天平( ×1) 2. 剪刀( ×1) ,镊子( ×1) ,研钵( ×1) 3. 试管架( ×1), 10mL 离心管( ×2),( 100 × 15) mm 试管( ×6) 4. 刻度吸量管( 2mL ×1,5 mL ×2), 1000 μL 微量可调取液器(×1) 5. 100mL 容量瓶( ×1) 6. 白瓷反应板( ×1) (二)实验样品和试剂 1. 鸡肝。 2. 95 %乙醇。 3. (5 %) 三氯醋酸溶液:称取未潮解的三氯醋酸( C2HCl3O2 , ) 5g ,加蒸馏水溶解至 100 mL 。 4. NaC l 溶液:称取 NaCl 加蒸馏水溶解至 1000 mL 。 5. 12mol/L HCl :浓 HCl 原液( 36%?38% )。 6. (50 % )NaOH :称取 NaOH 50g ,用蒸馏水溶解至 100mL 。 7. 碘试剂:碘 l00mg 和 K1 200mg 溶于 50mL 蒸馏水中。 8. 班氏试剂:称取柠檬酸钠( C5H5Na3O7 · 5H2O , ) 173g 和无水碳酸钠