文档介绍：白细胞介素文章来源: 2006-7-19 14:18:29 第四军医大学学报 1999 年第 20 卷第 2期郑强范清宇 0 引言基因治疗是指应用基因工程技术, 将外源性基因导入体内, 并表达产物, 从基因水平上治疗疾病. 目前研究较多为细胞因子基因修饰肿瘤细胞, 注入体内, 使肿瘤局部细胞因子浓度增高, 有效地激发和加强局部及全身的免疫功能, 避免因外源输入大量细胞因子而带来的一系列毒副作用. IL-2 动物实验及临床应用均证明其可产生抗瘤作用[ 1~3]5 ,但其全身大剂量、长时间应用可产生严重的毒副作用,为了使 IL-2 能于肿瘤局部分泌, 我室尝试用 IL-2 进行骨肉瘤基因治疗的实验研究. 为了研究肿瘤靶向的 IL-2 基因治疗,我们将 IL-2 基因转染人骨肉瘤细胞,观察了其体外生物学特性,为深入开展此方面研究创造条件. 1 材料和方法主要试剂逆转录病毒载体 pDOR-IL-2 由我室制备[ 4] ;人骨肉瘤细胞系Ma和 IL-2 依赖细胞系 CTLL , 由第四军医大学免疫教研室惠赠; G41 8 和 Lipfectin 均购自 GIBCO 公司;蛋白酶 k, IL-2 标准品均购自 Promega 公司. 基因转染和筛选人骨肉瘤细胞系 Ma 在含 100 mL/L 小牛血清的 RPMI 1640 培养基中常规培养, 细胞生长至对数期时更换新鲜培养基, 12 h 后以 1× 10~2× 10/mL 接种于 6 孔板,培养 24 pDOR-IL-2 , 10μL 脂质体( lipofectin )分别溶于 100 μL 无血清培养基,两溶液缓慢混匀, 室温放置 15 min , 加入 mL 无血清培养基, 混匀后加入上述培养细胞内, 55 常规培养 6h 后更换为 4 mL 含 200 mL/L 血清培养基,继续培养 48h 后, 用胰酶消化后以 1∶5 接种于含 600 mg/L G418 的培养基内, 阳性者为 Ma/IL-2 细胞,同法转染空载体 pDOR-neo. 细胞体外扩增情况的观察将 Ma , Ma/IL-2 细胞均调至深度为 5× 10/ 孔接种于 24 孔培养板中, 隔天取 3孔,2 g/L 台盼蓝染色, 计数取均值, 绘制生长曲线. 阳性细胞内 IL-2 cDNA 检测分别收集 Ma 细胞, 转染空载体的 Ma 细胞以及 Ma / IL-2 细胞,按参考文献[ 5 ]分别提取 3 种细胞的 DNA ,各取 DNA 约 μg, IL-2 cDNA 上、下游引物各 50 pmol , 94 ℃× 1 min , 55 ℃× 1 min , 72 ℃× 2 min ,共 30 循环, 72℃延伸 5 min ,电泳鉴定. IL-2 活性测定用 IL-2 依赖细胞株 CTLL , MTT 法测定 IL-2 的生物学活性 2 结果基因转染细胞及其筛选情况经 600 mg/L G418 选择 3d 后,培养细胞中开始出现大量死亡细胞( Fig 1),7d 存活细胞基本稳定, 为表达 neo 基因的转染细胞,在 G418 存在环境中继续生长, 逐渐增殖形成典型“细胞岛”( Fig 2). 对照 Ma 细胞经 400 mg/L G418 选择培养 4d