文档介绍：qPCR操作步骤
具体的操作步骤是，RNA提取，随机引物反转录，反转录产物10倍稀释，real-time 。一步法是把反转录和扩增联合起来做，不推荐使用。
具体的注意事项有
1：高质量的RNA获取沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀)，去上清;
6)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀)，超净台风干;沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
7)视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。
三、去基因组
使用RNase-free的DNase І(Promega)，按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。
RNA 
DNase І
30
20
µl
µl
µl
µl
µl
 
10 x buffer 
H2O(RNase free)
RNasin
10

总体积
100
µl
然后按以下步骤操作：
1) 加入等体积的苯酚/***仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15min，取上清。
2) 加入等体积的***仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。
3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，-20℃静置15min;
4)4℃下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清;
5)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)，超净台风干;
6)加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。
四、总RNA纯度和完整性检测
1)纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。
2)总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min，EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5s rRNA， 18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
五、逆转录
1. mRNA：
1) 在RNase free的PCR管中配置下列溶液.
Total RNA 
H2O

µg
µl
总体积
12
µl
2) 将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性;
3) 在该PCR管中加入下列试剂(Promega)
oligo（dT）
Random primer

0
µl
µl
µl
µl
µl
µl
 
10mM dNTP 
RNase inhibitor 
5 x buffer 
M-MLV
.5
总体积

µl
4) 将上述20μl反应溶液30℃保温10min;
5) 42℃保温50min;
6) 85℃保温10min;
7) -20℃保存。
2. microRNA：
使用茎环逆转录法，原理如下图：
1) 在去RNase的PCR管中配置以下溶液.
total RNA
X个miR逆转录引物
H

*X
µg
µl
2O
总体积

µl
2)将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构;
3) 在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：
10mM dNTP (promega) 
RNase inhibitor (promega)
U6逆转录引物
5x buffer 
M-MLV (promega)

µl
µl
µl
µl
µl
总体积

µl
4) 将3)溶液加入到1)溶液中，混匀后30℃保温10min;
5) 42℃孵育50min;
6) 85℃孵育10min灭活逆转录酶。
四、定量PCR检测
：
根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。
得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验