文档介绍：荧光定量PCR实验报告
目前需要检测抗癌药 A在不用时间点对某抑癌基因B表达的影响，根据该药物在文献记
录中发挥作用的时间点 0小时，6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA
请设计相关实验来检测药物A对基因B转录水平荧光定量PCR实验报告
目前需要检测抗癌药 A在不用时间点对某抑癌基因B表达的影响，根据该药物在文献记
录中发挥作用的时间点 0小时，6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA
请设计相关实验来检测药物A对基因B转录水平影响。
一、实验原理
所谓实时荧光定量 PC叱术，是指在PC或应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累
实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
研究表明，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代 Ct值。因此，只要获得未知样品的 Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。本实验主要采用 SYB戏光染料。在PCR^应体系中，加入过量SYB双光染料，SYB双光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而
保证荧光信号的增加与 PCRT物的增加完全同步。
二、实验试剂和器材
因RNA已提取，即应准备反转录和做PCR勺试齐I」：
逆转录酶(M-MLV ),核糖核酸酶抑制剂(RNasin), dNTP Taq DNA聚合酶(Taq DNA
polymerase ),随机弓I物(Randomprimers ),琼月旨糖(agarose ) 均为美国 Promega 公司产品；
荧光定量试剂盒： Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI
公司，合适的抑癌基因 A的引物、3 -actin引物。
器材：
ABI 7300 Real-Time PCR System
RS-28高速低温离心机
超低温冰箱
微量移液器
三、实验步骤
<1>,根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点，用抗癌药A在0小时，6小时，24小时
给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA
<2>反转录(RT):
反转录反应液组成如下表：
Mixed components for synthesis of cDNA first chain
ComponentVolume (?l )Concentration
5X
Primer1??l
M-MLV65 U/??l
Nucleasr-Free Water
Total25
42c反转录50min , 95c 5min灭活反转录酶。
<3>Syber Green 荧光定量 PC做测：
在冰上按下表加样，
PC取应液组成如下表:
Mixed components for polymerase chain reaction
Component
Volume (ul )
10
Mix
Primer1+1
H2O7
Total20
PC做的设置