文档介绍：抗环斑病毒转基因番木瓜55-1的PCR检测
【关键词】,转基因；番木瓜55-1；
摘要：目的建立对抗环斑病毒转基因番木瓜55-1进展品系鉴定的检测方法。方法采用改进十六烷基三***溴化铵(TAB)法及试剂盒方法进展番木瓜基因组DN番木瓜果肉直接破碎成泥，离心去水相后备用。
132试剂盒DNA提取方法采用DNeasyPlantiniKit试剂盒(美国Qiagen公司)，并按使用说明操作。
133改进TAB法取100g处理好的样品至2l离心管中，参加500μl2％TAB裂解液，65℃水浴30in。参加300μl***仿／异戊醇(24：1)充分混合约5in，12000r／in，离心5in。取上清，加1／10量的10％TAB液摇匀后再参加300μl***仿／异戊醇，处理同前，离心后取上清，加等量TAB沉淀液［1％TAB，50l／LTris-Hl,pH80，10l／l乙二***四乙酸(EDTA)］，摇匀，15in后12000r／in，离心10in，弃上清，加100μl高盐三羟***氨基甲烷-乙二***四乙酸缓冲液(TE)和5μl10g／lRNA酶，55℃温浴10in，加2倍体积冷无水乙醇沉淀，洗涤2次，风干，50μlTE溶解。
14核酸纯度及浓度测定采用紫外分光光度法测定所提取的核酸的纯度和浓度。
15PR检测
151引物根据转基因番木瓜55-1品系的质粒图谱〔1〕设计和合成。Papain(211bp)I：5′GGGATTTAGTGTTGTA3′Ⅱ：5′GAAATAAGTTGAT3′;NS35S(207bp)I：5′TTAGGGAGTTTGTTAGG3′Ⅱ：5′ATGTGTGAGAAATAGG3′;35SGUS(250bp)I：5′TTGAAGATTTTATA3′Ⅱ：5′TGTTAAAATGTGGA3′。
152反响体系25μl反响液中含10×PRBuffer25μl，25l／Lgl230μl，10l／LdNTP(freah)05μl，ixedpriers(15μl／Lfreah)04μl，Taq酶(5U／μl)02μl，UNG酶(1U／μl)03μl，DNA模板(10～50ng/μl)5μl。
153反响条件5℃3in；95℃预变性10in；95℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环；72℃延伸7in。
16凝胶电泳检测DNA提取液以08％琼脂糖进展凝胶电泳检测，以确定DNA提取结果；PR产物以15％琼脂糖进展凝胶电泳检测，以确定PR扩增结果。
17检测低限的测定为测定该方法对转基因番木瓜551的检测低限，采用紫外分光光度法测定试剂盒法提取的100％转基因番木瓜55-1种籽的DNA提取液的DNA浓度，然后对该DNA提取液以3倍为梯度进展稀释，共稀释7个梯度，使最终稀释倍数达2187倍。各取5μl稀释样品作为模板，进展35S-GUS序列PR扩增。
18实验对照以蒸馏水代替样品作为DNA提取空白对照；以蒸馏水代替样品作为模板作为PR空白对照。
2结果
21样品DNA提取结果本研究采用改进TAB法和试剂盒法分别对市售番木瓜的种籽和果肉及转基因番木瓜种籽进展DNA提龋DNA提取液的08％琼脂糖凝胶电泳结果显示这2种方法对番木瓜种籽的提取结果均较果肉的提取结果理想，在电泳图像上种籽的提取条带明显