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大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞的观察.doc

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文档介绍:大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞的观察
  宋嵬,曾水林,朱建宝,王磊,李升,阎荣,李凤飞
  【关键词】,大鼠;神经前体细胞;神经节,脊;细胞培养技术;免疫荧光组织化学
  bservatinfneuralpreursrellsinG,置于40g/L多聚甲醛内后固定,次日行冰冻切片,片厚15μ.将切片分为三套,分别行HE染色和BrdU/Nestin,P75/Nestin双标免疫荧光组织化学染色.HE染色:DRG切片入苏木精染液染色,水洗玻片上多余染液,10L/L盐酸乙醇分色.流水冲洗,反蓝.蒸馏水冲洗;1~5g/L伊红染液染色,依次经700,850,1000L/L乙醇脱水;二甲苯透明,封片.BrdU/Nestin双标免疫荧光组织化学染色:依次参加500L/L甲酰***,2×SS,1l/L盐酸,1g/L胰蛋白酶及封闭羊血清后,再参加小鼠抗大鼠BrdU抗体〔1∶200〕,4℃过夜,参加山羊抗小鼠IgG:TRIT〔1∶300〕,加封闭羊血清,加小鼠抗大鼠Nestin抗体〔1∶200〕,4℃8h,加山羊抗小鼠IgG:FIT〔1∶300〕,甘油缓冲液封片.P75/Nestin双标免疫荧光组织化学染色:依次加封闭羊血清,兔抗大鼠P75抗体〔1∶200〕,4℃过夜,参加山羊抗兔IgG:TRIT〔1∶300〕,小鼠抗大鼠Nestin抗体〔1∶200〕,4℃8h,山羊抗小鼠IgG:FIT〔1∶300〕,甘油缓冲液封片.1.2.2背根神经节细胞原代培养取孕14d大鼠于麻醉后取出胚鼠,别离出DRG,DE液冲洗,剪碎,放在300目的滤网研磨过滤.搜集过滤液,离心5in,1000r/in.弃去上清.再次离心后,所得细胞用含有EGF,bFGF的DE重悬.将细胞以1×108/L浓度接种于10L培养瓶内.置于培养箱中培养〔37℃,50L/L2〕.取成年大鼠麻醉后,脱颈处死消毒,解剖别离出DRG.将搜集到的神经节组织进展原代细胞培养〔方法同前〕.1.2.3细胞传代培养在细胞培养到7d时,用2.5g/L的胰酶消化5in,参加100L/L胎牛血清终止消化,再用吸管吹打成单细胞悬液,离心弃上清,反复两次.所得细胞用前述培养液重悬.将一局部细胞悬液调整成密度为1×108/L,种入新的培养瓶中,继续按照先前条件,置于培养箱培养.另取一局部细胞悬液,用培养液稀释到2×103/L,接种入96孔培养板中,每孔100μL.2h后在倒置显微镜下观察,对只有一个细胞的培养孔做标记.以后每天动态观察标记孔中单细胞的分裂和克隆形成情况.在细胞分裂增殖到一定程度后,按照同样的方法进展第二次传代.1.2.4培养细胞的鉴定选择第二次传代后有细胞增殖的培养孔,分为三组,前两组分别参加5μl/L的BrdU,100L/L胎牛血清,第三组不加任何物质.继续培养3d后,对参加BrdU的培养孔中的细胞进展抗BrdU的免疫荧光组织化学染色〔TRIT标记〕.对参加胎牛血清的培养孔的细胞分别进展GFAP,NF的免疫荧光组织化学染色〔GFAP用TRIT标记,NF用FIT标记〕.第三组进展Nestin免疫组织化学染色〔SAP法〕,苏木素复染.上述切片和培养细胞分别在普通和荧光显微镜、倒置显微镜下观察,并照相记录.
  2结果2.1HE染色在低倍光镜下可见,整个DRG呈梨形,其外膜的结缔组织伸入节内,把节内细胞分成多群.在高倍光镜下

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上传人:卢卡斯123 2022/7/3 文件大小:23 KB

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