文档介绍：大鼠大脑皮质神经元的原代培养
【摘要】目的讨论大鼠大脑皮质神经元的培养方法。方法体外原代培养新生大鼠大脑皮质神经元,应用免疫细胞化学法及电子显微镜鉴定神经元。结果用神经根底培养基(Neurbasal-A)+B27培养的神经元纯度可达8养4d后,突起进一步增多、增长。培养6d时,神经元胞体开场聚集,突起相连呈网络样生长(图1D)。培养7d,胞体聚集更明显。随着培养时间的延长,神经元突起纵横交织,难以识别突起的起源(图1E)。
取不同培养时间的细胞行NSE免疫组化染色发现:培养4d以前的细胞含有较多的非神经元细胞,神经元阳性率低;培养5d以后的细胞神经元阳性率增高,但其胞体开场聚集,甚至突起互相交织、难以识别突起的起源,染色阳性的神经元形态不典型。取培养4d的细胞进展染色,发现神经元的形态比拟典型,阳性率也较高,其结果显示:NSE阳性神经元的细胞质和突起呈棕色或棕褐色,细胞核淡染,神经元胞体呈圆形、椭圆形或锥体形等,有较长的突起伸出,突起为单极、双极或多极(图2)。阴性细胞的细胞质和突起未呈棕色或棕褐色。计算NSE阳性细胞百分率,神经元数目可达85%以上。
常规条件下培养4d的神经元超微构造最典型,在电镜下可见其细胞膜完好,细胞质含有丰富的核糖体、粗面内质网等细胞器;核大,呈圆形或椭圆形,常偏位,核膜完好,染色质分布均匀(图3)。
3讨论
神经元体外培养是神经元发育分化、神经再生、神经系统疾病的发活力制等众多研究领域的重要模型,该模型具有影响因素单一、机体复杂因素干扰少和结果易分析等优点。因此神经元体外培养随之成为神经科学研究领域的关键技术。在神经元的体外培养过程中应注意以下几个方面。
培养液是否适宜是神经元培养能否成功的关键因素之一。血清中含有多种蛋白质、多肽、激素、生长因子等营养物质可以促进神经元贴壁生长及对体外环境的适应,但血清对胶质细胞的增殖作用很强。在神经组织的别离细胞悬液中,除了神经元之外,还有一些非神经元细胞是无法完全去除的,包括神经胶质细胞、脑脊膜细胞以及成纤维细胞等［4］。因此所采用的培养液应尽量减低非神经元细胞的存活力,进步神经元的纯度。
以往神经元的培养多采用DE培养基,并以抗有丝分裂剂阿糖胞苷来抑制神经胶质细胞的生长［3,5］,获得较高的纯度。但阿糖胞苷对神经元亦有一定的毒性,对其活性有不同程度的影响,并且大量胶质细胞死亡后的产物也不利于神经元的生长。故本实验选用富含神经元生长所需的各种营养物质的神经根底培养基,它被认为是神经元培养的良好基质［6］。本实验对神经元原代培养方法的改良之处在于:不用阿糖胞苷等有丝分裂抑制剂,培养中不是全程使用有血清培养基,而是以有血清培养基(含10%胎牛血清的DF12培养基)作为种植液,种植培养4h后,全量换为无血清限定性培养基(Neurbasal＋B27)维持培养。由于培养中不参加阿糖胞苷,防止了其毒性作用。其中种植液中所含的血清可以保证细胞根本贴壁,进步了培养细胞的存活率;而维持液中的Neurbasal-A+B27添加物不仅可以促进原代培养神经元的存活和生长分化,还能抑制非神经元的分裂增殖［1］,因此大大进步了神经元的纯度。实验结果发现采用此法培养神经元时,神经元