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第三章 质粒载体.ppt

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文档介绍:第三章__质粒载体

第一页,共80页。

第一节 质粒载体的概况
质粒的定义、命名、分类、分布
质粒的基本生物学特性
质粒的分离与纯化

第二页,共80页。

一、质粒的定义、命名、分类、分布
定义:质粒是一类寄宿于十页,共80页。
1、***化铯密度梯度离心法

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优点:可获得高纯度、高质量的质粒DNA。
缺点:操作复杂;
价格昂贵(***化铯);
设备要求高(超速离心机);
易造成环境污染和人员伤害(溴化乙锭是一
种极强的诱变剂)

第二十二页,共80页。
原理:是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DN***断之间,在拓扑学上的差异发展出来的。
加热或PH介于12.0-12.5的范围内,线性DNA会被变性,两条链会完全分开。而超螺旋DNA由于双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用,互补的两条链仍会紧密结合在一起,不会被变性。
致冷或恢复中性PH值,变性处理的质粒和染色体DNA混合物便会迅速复性。共价闭合环状的质粒DAN,由于两条链在形体上仍保持在一起,复性迅速准确。随机断裂产生的线性的染色体DNA分子,互补链彼此已分开,复性就不会那么迅速而准确,它们聚集形成网状结构,通过离心会与变性的蛋白质及RNA沉淀下来。滞留在上清液中的质粒DAN则可通过乙醇沉淀法收集。
2、碱裂解法

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分离纯化质粒DNA的程序

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3、微量碱变性法提取质粒DNA步骤
离心收集细胞沉淀;
细胞悬浮液重新悬浮细胞;
裂解液使细胞裂解,释放出DNA,同时使DNA变性;
中和液使线性质粒和染色体DAN复性;
离心除去染色体DAN、蛋白质及RNA等复活物;
含有质粒超螺旋DNA的上清液用酚臭提除去蛋 白质;
乙醇沉淀收集质粒DNA。

第二十五页,共80页。
4、影响质粒DNA产量的因素
寄主菌株的遗传背景
质粒的拷贝数及分子大小
寄主菌株的生长条件
培养基的类型等

第二十六页,共80页。
1)寄主菌株的遗传背景
使用endA基因发生突变的(endAl)大肠杆菌寄主菌株,例如DH5,JM109
endA基因突变,使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力,增进了质粒DNA分子的稳定性。所以从这类寄主细胞制备的质粒DNA质量有所改进,产量也得到了提高。

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2)质粒的拷贝数及分子大小
细菌培养物中质粒DNA的理论产量是质粒拷贝数和分子量大小及每毫升培养物中大肠杆菌细胞总数三者乘积。
一般认为,在37度培养条件下震荡16小时的大肠杆菌肉汤培养基,每毫升含有2×109细胞。
质粒拷贝数的多寡是直接决定其DNA产量的重要因素;其次质粒分子大小也是决定DNA产量高低的重要因素,这点对重组质粒载体的影响尤为重要。

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第三节 质粒载体的构建
天然质粒用作克隆载体的局限性
质粒载体必须具备的基本条件
质粒载体的选择记号
不同类型的质粒载体

第三十页,共80页。
一、天然质粒用作克隆载体的局限性
天然质粒有 Co1E1、RSF2124和PSCl01等。
PSC102天然质粒的局限性:如质粒的分子量较大,拷贝数较低,只有一个抗菌素抗性基因,无法使用插入失活技术选择重组体分子等。COLE1天然质粒具有高拷贝数,可以根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择转化子,但这种筛选相当麻烦,影响它的使用。

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二、质粒载体必须具备的基本条件
具有复制起点;
具有可选择的标记;
具有若干限制酶单一识别位点;
具有较小的分子量和较高的拷贝数;
作为表达载体还有启动子,转录转移信号,终止子序列等片段。

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三、质粒载体的选择记号
在基因克隆中采用的质粒载体的选择记号,有新陈代谢特性、对大肠杆菌素E1 的免疫性,抗菌素抗性等。
使用抗菌素抗性记号有四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性,卡那霉素抗性等。
抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择的优点。

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四、不同类型的质粒载体
高拷贝数的质粒载体
低拷贝数的质粒载体
失控的质粒载体
插入失活型的质粒载体
正选择的质粒载体
表达型的质粒载体

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1、高拷贝数的质粒载体
克隆的目的若仅仅是为了分离大量的高纯度的克隆基因的DN***断,通常选择COLE1、PM

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