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第十一章电泳和电色谱.ppt

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文档介绍:第十一章电泳和电色谱

第一页,共53页。

生物分离过程的一般流程
原料液
细胞分离(离心,过滤)
细胞-胞内产物
路线一
路线二
细胞破碎
碎片分离
路线一A
路线一B
清液-胞外产物
粗分离(盐析、萃取、径5μm
E电场强度
ε介电常数
V0电渗流速度
ξwZeta电位
μL电渗淌度

第十六页,共53页。
四、影响电泳迁移速度的因素
样品性质
电场强度
缓冲液的性质
电渗
温度

第十七页,共53页。
(1) 样品性质:带电量,分子大小,形状
分子带电量越大、直径越小、形状越接近球形,则其电泳迁移速度越快
(2) 电场强度:电场强度对电泳速度起着决定性作用,电场强度越高,电泳速度越快
 过高,产热,样品和Buffer扩散增加,条带增宽,蛋白变性。
 过低,电泳时间增加,扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时(如高压电泳),需附有冷却装置

第十八页,共53页。
(3) 缓冲液的性质
a 缓冲液的pH
pH 决定带电量,(pH-PI)越大,带电量越多,迁移速率越大
b 离子强度
I越大,样品电流减小,迁移率变小;I越小,样品电流越大,迁移率越大,但样品易扩散,一般I在0.02-0.2M
选择合适的pH,使各种蛋白质所带电荷差异较大,利于彼此分开;电泳过程中须采用具有一定缓冲能力的缓冲液使pH值恒定 。

第十九页,共53页。
(4) 电渗
当电渗方向与电泳方向一致时,会加快颗粒泳动速度,反之,当两者方向相反时,会减慢颗粒泳动速度。
(5)温度:过高,由于产热增加、水分蒸发,对电泳不利。

第二十页,共53页。
第二节 凝胶电泳

第二十一页,共53页。
利用凝胶的分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离。
相对分子质量大的溶质受凝胶阻滞作用大,泳动速度较慢,而小分子溶质泳动速度较快。经过一定时间的电泳后,根据溶质相对分子质量的不同,凝胶中形成数条含有不同溶质的区带,实现溶质之间的相互分离。是区带电泳分离法
一、 凝胶电泳原理

第二十二页,共53页。
凝胶电泳与凝胶过滤的区别:
凝胶电泳:样品中各分子的运动速度是小分子快于大分子
凝胶过滤:大分子运动快于小分子
 原因:凝胶电泳中,系统里没有空隙体积,只有网状骨架。大分子物质不及小分子物质容易移动。

第二十三页,共53页。
1.板式凝胶电泳
处理量很小,不适合生物产物的分离制备。
水平式平板凝胶电泳
垂直式平板凝胶电泳
凝胶电泳的类型

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2.圆柱型凝胶柱
凝胶切成圆片,分别溶出各个组分。 缺点:操作过于繁琐,回收率不高,且易变性

优点:操作简便,凝胶可重复使用。
缺点:回收的溶质浓度很低。
连续洗脱凝胶电泳:当溶质泳动到凝胶末端时,通入洗脱液分别回收各个组分。

第二十五页,共53页。
---根据溶质的相对分子质量选择
7.5%的聚丙烯酰***凝胶
 孔径较小,适用于相对分子质量为10kD~1000kD的溶质的分级分离;
3.5%的聚丙烯酰***凝胶
 孔径较大,适用于相对分子质量为1000kD -5000kD的溶质的分级分离
聚丙烯酰***与琼脂糖的混合凝胶,或纯琼脂糖凝胶
 孔径更大,适用于分离相对分子质量更大的溶质。
 核酸的分离通常采用0.5%-1%的琼脂糖凝胶
凝胶种类和浓度

第二十六页,共53页。
电泳槽
制备胶板
放置样品梳
加样
电泳
观察和拍照
凝胶电泳操作步骤

第二十七页,共53页。

第二十八页,共53页。

制胶或染色时加入的染料EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套

第二十九页,共53页。
M 1 2 3 4
PCR产物的
琼脂糖凝胶电泳

第三十页,共53页。
由浓度不同的两层凝胶组成:浓缩层和分离层
上层凝胶:浓缩层
凝胶浓度较低(丙烯酰***浓度为2%~3%Tg),孔径较大,凝胶对溶质的泳动无阻滞作用,溶质以等速电泳的形式泳动,得到浓缩。
下层凝胶:分离层
凝胶浓度较高(5%~25%Tg),各个组分根据迁移率的差别得到分离。
二、不连续凝胶电泳

第三十一页,共53页。

第三十二页,共53页。

第三十三页,共53页。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
不连续电泳的三个不连续性:
a.凝胶浓度的不连续性(分离胶浓度>浓缩胶)
b.缓冲液pH值的不连续性
c.缓冲液离子成分的不连续性
不连续电泳的不连续性
浓缩层凝胶缓冲液为pH6.8的Tris-HC1;分离层凝胶缓冲液为pH8.9的Tris-HC

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