基因扩增技术.ppt

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基因扩增技术
Polymerase chain reaction又称无细胞分子种模板DNA, 每种引物都进行
Mg2+浓度的优化。
三磷酸脱氧核苷（dNTPs）
四种三磷酸脱氧核苷（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，工作浓度应为20~200mmol/L。所用的四种dNTP的浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。dNTPs浓度过低则反应速度下降，dNTPs浓度过高则扩增特异性降低，而且当dNTP浓度高于50mM时也会抑制Taq DNA聚合酶的活性。
耐热DNA聚合酶
Taq聚合酶是从耐热菌（thermus aquatious）中提取出来的耐热酶，95℃仍有活性。该酶的应用浓度一般为1~L反应体系，然而，酶的用量可依据不同的模板分子或引物而变化。酶浓度过高时，会出现非特异性扩增；过低时扩增产物量很低。
试剂 原液浓度 工作浓度 50l体系
PCR缓冲液 10 1 5L
上游引物 50mol/L mol/L L
下游引物 50mol/L mol/L L
dNTPs 10mmol/L 200mol/L 4L
MgCl2 25mmol/L L
Taq酶 5U/L L体系 L
DNA模板 102-105拷贝
ddH2O 补足50L
PCR混合液
PCR产物的分析
半定量RT-PCR原理：
持家基因：在所有类型组织和细胞中普遍表达恒定的基因。如2微球蛋白、-肌动蛋白和GAPDH基因。
在逆转录过程中，“持家基因”的mRNA与待测模板的mRNA共同逆转录为cDNA，因此排除了cDNA合成效率不同所引起的误差。在此后的PCR反应过程中，“持家基因”的cDNA与待测模板cDNA用不同的两对引物在同一PCR体系内扩增。待测模板扩增产物与该样品“持家基因”扩增产物的比
值可以反映待测模板表达量的相对高低。
持家基因选择的原则
在欲分析的组织或样品中该持家基因的表达稳定。
RNA 特异性的检测，注意假基因的干扰。
持家基因的拷贝数和预测基因的拷贝数在同一线性范围内。
常用持家基因表达的稳定性
常用持家基因在基因组序列中存在假基因情况
不同类型细胞中持家基因表达的稳定性
Vandesompele, J., K. De Preter, et al. Genome Biol, 2002
不同类型组织中持家基因表达的稳定性
de Kok, J. B., R. W. Roelofs, et al. Lab Invest,2005
在前列腺癌组织中一些持家基因表达的稳定性
Fig. Selection of the most suitable reference genes for normalization in prostate cancer samples using geNorm analysis by calculating the average expression stability measure M, and the least stable gene with the highest M value.
Ohl, F., M. Jung, et al. J Mol Med, 2005
PCR产物的分析
如何调整PCR产物在直线期：
一管PCR法（减少持家基因引物量）
两管PCR法（同一混合液，同一PCR程序）
如何调整不同样品间持家基因的差异
RNA水平调整（加大模板量）
cDNA水平调整（加大模板量，最多2uL)
电泳水平(持家基因与欲测基因体积一致）
待测模板的相对含量 = 样品荧光强度/内参照模板的荧光强度
RT-PCR实验的策略
1、热启动
Taq酶在低温下仍有活性，故PCR混合物在显著低于Tm值 的温度下，Taq酶可催化引物与模板的非特异复性或引物
二聚体的形成。
在第一个循环的变性温度加入Taq酶；
将含有Mg2+的石蜡珠放在管内，待达到变性温度
时，石蜡熔化，Mg2+进入反应液中，起始反应；
在PCR反应液中，加入Taq酶的单克隆抗体，在温度升高到将中和抗体变性失活之前，抗体与Taq酶结合，使其不
能发挥作用。
RT-PCR实验的策略
2、优化Mg2+浓度
应用不包含 Mg2+的PCR缓冲液，将10mmol/L MgCl2贮存液逐一加入反应管中。（0.