蛋白冻干保护剂.ppt

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《蛋白冻干保护剂》
第五章 冷冻干燥的保护剂和添加剂
添加剂作用机理的几种说法
冷冻干燥配方需要注意的问题
冷冻干燥配
此文档后面有赠送常用红外线频谱仪（FTIR）对蛋白质分子的结构以及蛋白质与保护剂之间的氢键作用进行直接检测，为该理论提供了证据。
波 长cm-1
------天然蛋白质溶液 —含有添加剂的蛋白质溶液
干扰素-γ分别在冷冻干燥固体状态和复水后的频谱图
冻干干扰素-γ的频谱图。含有浓度为1M蔗糖的冻干干扰素-γ的频谱，与天然水溶液蛋白质极为相似；而没有蔗糖时，频谱差异较大。在不含蔗糖的干燥样品中，在1656cm-1处出现吸收率减少，表示α-螺旋结构的损失，作为补偿，相应地分别在1640-1645cm-1和1665-1695cm-1处出现吸收率增加而转换成β-折叠和弯曲（turns）结构。β-折叠结构的优先出现，是对蛋白质与水之间氢键作用减少的一种补偿，即代表了干燥样品中氢键作用损失的最大程度。
3. 贮藏过程中的保护机理
和冷冻干燥过程一样，在冻干制品的长期贮藏过程中也存在着多种影响因素。两者之间的主要区别在于时间尺度上。干燥过程中出现的引起蛋白质变质的时间尺度为小时；而对于贮藏而言，时间尺度为月或年。在正确的冷冻干燥工艺中，要求产品温度接近于其玻璃化转变温度；而在正确的贮藏条件下，环境温度应当比其玻璃化转变温度低得多，以获得很长的松弛时间。
在冻干生物制品的长期贮藏过程中，各种赋形剂对它的保护作用机理，同样有“玻璃态假说”和“水替代假说”之争论。
冷冻干燥配方需要注意的问题
由于生物物料中活性组分各不相同，因而一般均须针对物料单独配方。为了确保生物制品冷冻干燥后最大程度地获得活性恢复率，必须充分考虑各种保护剂和添加剂与生物制品活性组分之间的最大相容性。

由于生物制品中的活性组分（如蛋白质）只有在很小的pH值范围内才是稳定的；并且不同的pH环境会影响某些蛋白质的溶解性。所以，选择最优的pH环境有利于蛋白质的稳定性和它在溶液中的溶解性。例如，在中性环境中冻结卵清蛋白（ovalbumin），不会导致蛋白质变性，，蛋白质的结构发生了明显的变化。
另外，冷冻干燥配方的pH值对冻干生物制品长期贮藏的稳定性也会带来很大影响。酸碱度会影响固体状态下蛋白质的物理和化学稳定性。例如，冻干的核糖核酸酶（RNase）在贮藏过程中发生不可逆聚集程度就与蛋白质溶液冷冻干燥前的pH值有关。

有许多缓冲剂能够用于生物制品的冷冻干燥配方中，但是，并非每一种缓冲剂都能够用于任何溶液，例如，对pH敏感的蛋白质溶液，就应当避免使用磷酸钠缓冲剂，这是由于在冻结过程中，Na2HPO4易于优先结晶，使得溶液的pH值降低，最终引起蛋白质变性。
另外，正确选择缓冲剂的浓度也是很重要的。例如， β-牛乳糖水溶液（2μg/ml）冷冻干燥过程中，因为甘露醇结晶而不能起到保护作用。当添加浓度为10mM的磷酸盐缓冲液（）后，部分抑制了甘露醇的结晶，并且酶的活性达到95%；而将磷酸盐缓冲液（）的浓度提高到200mM就能够完全抑制甘露醇结晶。

在生物制品的配方中添加一种易于结晶的填充剂，可以取得一些功能：为最终的冻干产品提供足够的机械支撑作用；改进冻干制品的外观；提高配方的溶解度；防止冻干制品发生塌陷和溢出容器。
为此填充剂的选择要满足以下几点：有相当好的溶解性；与生物制品中活性组分相容；没有或者很小的毒性；以及具有较高共晶温度。甘露醇和甘氨酸就是两种常用填充剂。
冷冻干燥生物制品配方中的有些赋形剂可能会抑制填充剂的结晶，从而影响生物制品的稳定性。甘露醇与蔗糖、海藻糖、乳糖或麦芽糖的混合物中，只有当甘露醇的浓度达到30%（w/w）以上，才有结晶现象。
、干燥保护剂的选择
糖类是生物制品冷冻干燥过程中使用最频繁的保护剂，这是因为大多数糖在正常操作条件下不会结晶。并且，一般不选用还原性糖，因为它可能与蛋白质之间发生Maillard反应。蔗糖、海藻糖是最常用的保护剂。
某些聚合物，因其能提高玻璃化转变温度，而常被用作保护剂。但是，聚合物与蛋白质分子形成氢键的能力远远低于糖类，所以常常采用聚合物与糖联合使用。这样既可以提高配方的玻璃化转变温度，又可以与蛋白质形成很强的氢键作用。
生物制品中活性组分如蛋白质也属于聚合物，具有较高的玻璃化转变温度。因此，提高蛋白质与赋形剂之间的质量比率也可以明显提高生物制品冷冻干燥配方的玻璃化转变温度；并且，提高蛋白质的浓度还可以抑制赋形剂的结晶。当然，蛋白质的浓度也不能提高