文档介绍：HUAZHONGAGRICULTURALUNIVERSIH
现代生物学技术
实验报告
题目蛋白质双向电泳技术
姓名学号
专业
小组成员
指导教师
中国•武汉
年月
联系方式:
大肠杆菌组蛋白双向电泳技术
摘要：蛋（每组做4管，做好标记）。
8、混匀后，放置在冰上5min。
9、12000rpm,4C离心10min,倒掉上清
10、加入1ml丙酮洗涤沉淀，12000rpm,4°C离心5min,重复三次
11、最后倒出丙酮后，再短暂离心，用移液枪吸出残余的丙酮
12、打开离心管的盖子，室温放置10T5min,使丙酮完全挥发
13、向离心管中滴加50ul样品溶解液，4C放置至少3h，溶解蛋白样品。

1．
氯化钠
8g
氯化钾

NaHPO

24
KHPO

24
向烧杯中加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解
,然后加入去离子水定容至1L
灭菌后室温保存
2■蛋白沉淀剂40%三氯乙酸（TCA）
40gTCA加水定容至100ml
3．丙酮
4．核酸酶

（cocktail,片剂）
6．样品溶解液：
尿素7M

硫脲2M

CHAPS
4%

MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml,-20°C冰箱保存。
注：不要反复冻融，分装保存

OD
步骤:
标准曲线法测定蛋白质的含量
管号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白液(mL)
0

蒸馏水(mL)
1

考马斯亮蓝G-
250(mL)
4
4
4
4
4
4
蛋白含量(Ug)
0
10
20
40
60
80
0

595nm
1、，标记管号1-7
2、在1-6号管中，按上表加入标准蛋白液()，蒸馏水，
考马斯亮蓝R250，混匀后室温放置5min
3、从冰箱中取出溶解的蛋白样品，用移液枪反复吹打几次，12000rp叫
4C离心10min,之后将上清转移到一新的离心管中
4、取合适体积的蛋白样品加入7号管中，加蒸馏水补足至1ml,考马斯
亮蓝G-2504mL，混匀后室温放置5min.
5、用分光光度计测得1-7号管中溶液的光密度OD,(测之前注意调
595nm
零,以1号管为空白对照调零)
以A为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标(六个点为10卩g、20|ig、595nm
30卩g、40卩g、50卩g),在坐标轴上绘制标准曲线。
6、利用标准曲线查出回归方程A595nm二aX+b。
7、根据回归方程计算样品蛋白质含量
实验结果：经试验得知：标准曲线方程为Y=+
其中，丫：吸光度（od595值）
595nm
X：蛋白质含量（g）
第一向分离——等电聚焦

从-20°C取出保存的水化上样缓冲液，置室温溶解。
从小管中取出水化上样缓冲液，加入适量样品、两性电解质（-1%）和溴酚蓝，充分混匀。
沿着聚焦盘中槽的边缘从左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
取出-20C冷冻保存的IPG预制胶条（7cmpH3-10），室温中放置10分钟。
而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。
5■将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产生气泡。
在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油（根据不同胶条长度，）,防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置等电聚焦程序。
7cm胶条
水化12小时（20°C）主动水化（50V）
S1
250V线性
30分钟
除盐
S2
500V快速
30分钟
除盐
S3
4000V线性
3小时
升压
S4
4000V快速
20,000伏小时
聚焦
S5
500V快速
任意时间
保持
选择所放置的胶条数。
设置每根胶条的极限电流。（50A/根）