文档介绍：质粒DNA提取方法的研究进展
摘 要:在生物实验中,质粒DNA常常作为基因载体运载工具使用,应用非常广泛,质粒DNA的提取通常在实验室内进行,保证其提取的效率和质量对生物实验研究具有重要意义,基于此本文对质粒DNA的提出方法进质粒DNA提取方法的研究进展
摘 要:在生物实验中,质粒DNA常常作为基因载体运载工具使用,应用非常广泛,质粒DNA的提取通常在实验室内进行,保证其提取的效率和质量对生物实验研究具有重要意义,基于此本文对质粒DNA的提出方法进行了探讨。
关键词:质粒DNA;提取方法;研究
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位,当前通常用其来特指细菌、真菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程领域,质粒常常被当做基因的载体使用。在分子生物学中,质粒DNA被当做基因运载工具具有非常广泛的应用。在质粒DNA的应用过程中,其纯度对于酶切、PCR扩增等实验结果有着比较大的影响,因此需要保证质粒DNA提取的纯度和效率。
在细菌中提取质粒DNA通常按照以下步骤进行:第一步,培养细菌,使质粒扩增;第一步,进行细菌的收集和裂解;第三步,质粒DNA的分离和纯化。在质粒DNA的提取过程中,其提取效果和其大小呈现出正比例关系,越小越容易进行提取,这主要是由于,如果质粒DNA比较大的话,其特性机会和染色体DNA比较接近,这样想要将二者分离开来难度就会变大。在进行质粒DNA的分离时,适宜的条件是非常重要的,主要包括pH值、SDS浓度、时间和溶菌温度等,在适宜的条件下质粒DNA和染色体DNA才能够更好的分离开来。细菌浓度对于质粒DNA的提取也是非常重要的,如果细菌的浓度比较高,那么在溶菌时,溶菌液很难和细菌液充分混合,导致溶菌不彻底的问题,这样会造成质粒的回收率比较低;而如果细菌溶度比较低,溶菌液和菌液均分混合,会造成溶液中含有较多的蛋白质、染色体以及菌体碎片,在这样的情况下,沉淀时质粒回合这些物质共沉,进而导致质粒的回收率也会比较低。在生物学的相关研究之中,细菌质粒DNA的提取是比较常规的技术和操作,主要的方法有碱裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等,下面对这些方法的最新研究进行介绍。
1 碱裂解法
碱裂解法是当前应用比较广泛的质粒DNA提取方法,这种方法的优点在于提取的质粒DNA纯度高,操作便捷,缺点是需要较长的提纯时间。研究人员在缩短这一方法的提纯时间方面做了大量的研究,但是没有得到理想的效果,。碱裂解法提取质粒DNA的基本原理:首选,在菌液中加入溶液Ⅰ,使细菌细胞悬浮,同时其中的EDTA会和Ca2+以及Mg2+螯合,起到抑制DNase活性的作用;然后,加入溶液Ⅱ,将细胞裂解,在这个过程中蛋白质和少量质粒将会变质;再次,加入溶液Ⅲ,使多数蛋白质以及染色体DNA被沉淀,并使得质粒DNA复性。其中,该方法中起到裂解细菌作用的主要是溶液Ⅱ中的NaOH,正因如此该方法被称为碱裂解法,如果将其换为SDS,也能够提取出少量的质粒DNA,这是由于SDS也是碱性的,可以一定程度上破坏细菌的细胞膜。在这一方法中需要注意,NaOH溶液要现用现配,这个主要是由于其能够和空气中的CO2反应,从而使溶液的碱性降低,这样会影响提纯的效率,另外在加入溶液Ⅱ之后,操作时