文档介绍：实验中心网站: http://hx./ *** 2017 年6月 17 日星期六动物细胞原代培养 ~ 动物细胞原代培养 2【实验目的】一、掌握无菌操作技术。二、了解小鼠解剖操作技术。三、了解原代细胞培养的一般方法与步骤。四、了解培养细胞的消化分散。五、了解细胞计数方法。六、了解倒置显微镜的使用。动物细胞原代培养 3【实验原理】细胞培养: 是将机体内的某组织取出,分散成单细胞,在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老,死亡等生命现象。还可以利用培养细胞制备染色体,分析外界因素(如理化因素)对细胞的影响,研究细胞癌变等等。在细胞培养的基础上发展了细胞融合、细胞杂交等细胞工程技术及单克隆抗体技术。( 分为植物细胞培养及动物细胞培养) 动物细胞原代培养 4 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。直接从有机体获取的细胞进行的培养是原代培养。将培养细胞洗脱后转移到另外的容器中进行在培养叫做传代培养。动物细胞原代培养 5【实验步骤】 (超净台的使用) •早期细胞培养,依靠的是精湛的操作技术和尽可能的靠近火焰一达到细胞的无菌化。•目前,超净台是使工作台无菌化最经济有效的手段。••实验进行前,无菌室及无菌操作台实验进行前,无菌室及无菌操作台(laminar flow) (laminar flow) 以紫外灯照以紫外灯照射射30-60 min 30-60 min 灭菌,以灭菌,以 70 % 70 % 酒精擦拭无菌操作擦拭无菌操作台台面,并开启无菌面,并开启无菌操作台风扇运转操作台风扇运转 10 10 min min 后,才开始实验操作。后,才开始实验操作。动物细胞原代培养 6 超净台表面的处理。 a. 应做到每日清洁,以使操作中溅出的培养液或其它液体及时被清除而不蓄积,达到杜绝细菌和真菌繁殖的目的。 b. 工作台中只限放置每日工作所必需的物品,其他非必须物应当除去。 c. 日常的清洁工作包括:用 70% 的酒精或 10% 的新洁而灭擦洗工作台。用固定的容器装废弃液。 d. ,且即使培养基相同亦不共每次操作只处理一株细胞株,且即使培养基相同亦不共享培养基,以避免失误混淆或细胞间污染。操作间享培养基,以避免失误混淆或细胞间污染。操作间隔应让无菌操作台运转隔应让无菌操作台运转 10 min 10 min 以上后,再进行下一以上后,再进行下一个细胞株之操作。个细胞株之操作。动物细胞原代培养 7 用于细胞培养的器材包括:细胞培养瓶,细胞培养板,吸管,各种瓶子等。目前,上述器材均可以从商家买到无菌一次性的用品。但是, 成本太高。玻璃器材,经过湿热或者干热灭菌后可以反复使用。不宜进行高温高压灭菌的器材,可以浸泡在 70% 乙醇中进行消毒,并在超净台上吹干。动物细胞原代培养 8 3. 实验者的操作技术无菌操作的原则:保证细胞培养板,细胞培养皿,细胞培养瓶内部以及吸管包裹层等内部的无菌状态。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以 70 % 酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。动物细胞原代培养 9 小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约 45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装置的工作间里进行。培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开。装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外打开。动物细胞原代培养 10 细胞培养中液体的吸取,均需机械移液装置移取。切勿采用口吸的方法。口吸是最大的微生物污染源,更重要的是细胞培养液及成分通过食入或吸入的方式及入人体,可能对研究人员造成伤害。细胞培养瓶在超净台中打开后,瓶盖应盖顶超下放置与工作台中。如果培养的细胞已经被污染,切勿直接倒掉, 应高压灭菌后倒掉处理。