文档介绍：Western Blot (免疫印迹) 【配胶】 10 % 过硫酸铵(APS) (1 )称量 1g 过硫酸铵。(2 )加入约 10 ml 去离子水后搅拌溶解。(3 )储存于 4 oC。注意: 10 %过硫酸铵溶液在 4 oC 保存时可使用两周左右,超过期限会失去催化作用 30 %丙稀酰胺( 100ml ) (1 )称量下列试剂置于烧杯中。丙烯酰胺( Acrylamide ) 29g 双丙烯酰胺(BIS) 1g (2 )加入约 60 ml 去离子水,充分搅拌溶解。(3 )定容至 100 ml, 用 µm 滤膜滤去杂质。(4 )于棕色瓶中 4 oC 保存。注意: 1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性,并可通过皮肤吸收,其作用具有积累性,配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为有可能含有少量的未聚合成分。 10% SDS ( 1)称量 10g高纯度(电泳级)的 SDS 置于 100~200 ml烧杯中。(2)加入约 80ml 去离子水, 68 oC加热溶解。(3)滴加数滴浓盐酸调节 pH 值至 。( 4)定容至 100 ml ,室温保存。#玻璃板对齐后放入夹中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶。#10% 分离胶在加入 后,取 200ul 于干净 EP 管中,再向 EP 管中加 3ul TEMED ,立即加入电泳槽中,用来封底,防止漏胶。#按上表配 10% 分离胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时,胶要沿玻璃一端流下。待分离胶胶面上升到合适高度( 用梳子比量一下, 大约离梳子下缘一指位置)。#然后向分离胶上加一层水压胶,液封后的胶凝的更快。( 灌胶时开始可快一些,胶面快到所需要高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。如果有小气泡,加水至水溢出,气泡便可随溢出的水而被带出。加水液封时要很慢,否则胶会被冲变形.) # 当水和胶之间有一条折线时,说明胶已凝。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去分离胶上层水并用吸水纸将水吸干。(封胶大约需要 30min ) # 按上表配 5% 浓缩胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶,然后将梳子插入浓缩胶中( 梳子光面朝向自己, 插梳子时要使梳子保持水平)。(灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。) # 由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程要经常在两边补胶(其实说经常有点过了,补 1—2 次就行了,不补胶问题也不大。) #套上塑料袋, 4度过夜。或室温下 1h左右胶便可凝固。【加样】#隔夜取出或室温 1h胶凝固后,将梳子垂直拔出。#用水冲洗几次浓缩胶。(注意动作要轻柔) #将胶放入到电泳槽中# 测完蛋白含量后,计算含 20--50ug 蛋白的溶液体积即为上液量。取出上样样品至 200ul 的 EP管中,加入 5*SDS 加样缓冲液至终浓度为 1*.( 上样总体积一般不超过 15ul , 加样孔的最大限度可加 20ul 样品) 。上样前要将样品于沸水中煮 5min — 10min 使蛋白变性。( 在水中煮蛋白有 2 个弊端:(1 ) EP 管容易炸开, 样品丢失; (2) 容易进水, 使样品体积增加, 超过电泳最大上样量。可以使用 PCR 仪进行变性