文档介绍：SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
实验目的
了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。
学习并掌握SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。
实验原理
SDS-PAGE电泳法,即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法,。
。
,加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS),SDS是一种阴离子表面活性剂,加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质分子上(在一定条件下,),使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷,其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时,蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小,而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
3. 当蛋白质的分子量在15000~200000之间时,电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系,符合下列方程:
1gMr =K―bmR
式中:Mr为蛋白质的分子量;K为常数;b为斜率;mR为相对迁移率。在条件一定时,b和K均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图,可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
仪器、原料和试剂
仪器:垂直板型电泳槽;直流稳压电源;50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅,染色槽;烧杯;吸量管;常头滴管等。
原料:~1mg·ml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液,也可配成混合蛋白质标准液。
试剂:
(1)分离胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液 ):取1mol/L盐酸48mL,Tris ,用无离子水溶解后定容至100mL。
(2)浓缩胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液 ):取1mol/L盐酸48mL, Tris ,用无离子水溶解后定容至100mL。
(3)30%分离胶贮液:配制方法与连续体系相同,称丙烯酰胺(Acr) 30g及N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis),溶于重蒸水中,最后定容至100ml,过滤后置棕色试剂瓶中,4℃保存。
(4)10%浓缩胶贮液:称Acr 10g及Bis ,溶于重蒸水中,最后定容至100mL,过滤后置棕色试剂瓶中,4℃贮存。
(5)10%SDS溶液:SDS在低温易析出结晶,用前微热,使其完全溶解。
(6)1%TEMED;
(7)10%过硫酸铵(AP):现用现配。
(8)电泳缓冲液(Tris-):称取Tris , , SDS , 用无离子水溶解后定容至1L。
(9)样品溶解液:取SDS 100mg,,甘油1mL,溴酚蓝2mg,,,加重蒸水至10mL(遇液体样品浓度增加一倍配制)。用来溶解标准蛋白质及待测固体。
(10)染色液:-250,加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。
(11)脱色液:75mL冰乙酸,875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。
实验步骤
1. 安装夹心式垂直板电泳槽:目前,夹心式垂直板电泳槽有很多型号,虽然设置略有不同,但主要结构相同,且操作简单,不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意:安装前,胶条、玻板、槽子都要洁净干燥;勿用手接触灌胶面的玻璃。
:根据所测蛋白质分子量范围,选择适宜的分离胶浓度。本实验采用SDS-PAGE不连续系统,按下表的配制分离胶和浓缩胶。
试剂名称
配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml
配制10ml浓缩胶所需试剂用量
5%
%
10%
15%
3%
分离胶贮液
(30%Acr-%Bis)

-
分离胶缓冲液
(-HCl)

-
浓缩胶贮液
(10%Acr-%Bis)
-
-
-
-

浓缩胶缓冲液
( Tris-HCl)
-
-
-
-

10% SDS

1%TEMED

重蒸馏水

混匀后,置真空干燥器中,抽气10min
10%AP

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