文档介绍：关于蛋白质的分离纯化与定性定量分析
第一张，共一百张，创建于2022年，星期一
什么是蛋白质的分离纯化
分离：将蛋白质混合物分成单一的蛋白成分。
纯化：得到单一蛋白的纯品。
第二张，共一百张，创建于2022年，星期一
利用物质的电荷与层析载体（离子交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离纯化的目的，属于吸附层析。
离子交换层析的固定相称为离子交换剂，由基质和基团两部分组成。
基质：纤维素、琼脂糖、葡聚糖、苯乙烯-二乙烯苯等高分子聚合物；
基团：共价结合在基质上的带电基团，可分为正电基团和负电基团。
第十八张，共一百张，创建于2022年，星期一
第十九张，共一百张，创建于2022年，星期一
Ion-Exchange chromatography
If pH mobile phase =
Then charge of the proteins: (-) (-) (+) (+)
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Anion exchange column = + charged
第二十张，共一百张，创建于2022年，星期一
Increased salt concentration
Ion-Exchange chromatography
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
+
+
+
+
+
+
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
Na+
Na+
Na+
第二十一张，共一百张，创建于2022年，星期一
基本操作过程
样品制备，装柱与平衡
上样（样品溶解于A液中）
洗脱：穿透峰，洗脱峰
收集、鉴定
第二十二张，共一百张，创建于2022年，星期一
离子交换层析有两种洗脱方式
分步洗脱：用间断地递增的不同离子强度的流动相分次洗脱样品蛋白的方法；
梯度洗脱：连续改变流动相离子强度的方法。
目前随着层析的自动化，梯度洗脱成为大多数情况下的首选方案。
第二十三张，共一百张，创建于2022年，星期一
分步洗脱
第二十四张，共一百张，创建于2022年，星期一
梯度洗脱
第二十五张，共一百张，创建于2022年，星期一
2. 凝胶过滤层析
利用分子量不同的蛋白质，通过凝胶分子筛时速度不同来分离蛋白质的方法。
固定相：凝胶颗粒（gel bead），多孔的网状结构，其网孔决定了凝胶的分级分离范围，即能被该凝胶分离的蛋白质混合物的Mr范围，如Sephadex G-50的分离范围是1500～30000。
常用的凝胶有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、Superdex等。
第二十六张，共一百张，创建于2022年，星期一
Size-exclusion chromatography
第二十七张，共一百张，创建于2022年，星期一
Size-exclusion chromatography
Absorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions. You can also perform an enzyme specific assay.
第二十八张，共一百张，创建于2022年，星期一
要根据待分离物质的分子量，选择特定的凝胶过滤基质；
凝胶过滤层析不仅可用于亲水性分子的分离，也可用于疏水性分子的分离，当用于疏水性分子分离时，该类层析往往被称为“凝胶通透层析”；
凝胶过滤层析可提供样品的分子量信息；
凝胶过滤的上样量一般在柱床体积的1～5％；
凝胶过滤的样品浓度越大越好，但一般不要超过100mg/ml。
凝胶过滤的注意事项
第二十九张，共一百张，创建于2022年，星期一
第三十张，共一百张，创建于2022年，星期一
3. 亲和层析
以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子的特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗原与抗体，激素与受体，糖与凝集素……等。
将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之固定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。
第三十一张，共一百张，创建于2022年，星期一
Affinity chromatography
Makes use of specific binding interactions between molecules
1-