Westernblot实验步骤.doc

文档介绍：Western blot实验:
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(1)聚丙烯酰胺垂直电泳及转膜系统美国 Bio Rad 公司
(2) HPIAS-1000型图像分析系统日本 Olympus 公司
(3) IX70型荧光倒置显微镜日本 Olympus 公司
(4) 高速冷冻离心机德国 Eppendorf 公司
(5) 超低温冰箱日本 Sanyo 公司
(6) CO2培养箱美国Shill公司
(7) 超净台苏州净化设备公司
(8) 微量移液器德国Eppendorf 公司
(9) 电子分析天平美国sartorius公司
:(中英文,购买厂商
Cyclin D一抗
P38 一抗
β-actin 一抗
MMP-9一抗美国Santa Cruz 公司
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔(HRP Goat anti-rabbit IgG),山羊抗小鼠二抗(HRP Goat anti-mouse IgG) 武汉博士德公司
BCA蛋白定量试剂盒康为世纪公司
Western blot 荧光检测试剂盒(Chemiluminescent Substrate)
Santa Cruz 公司
聚丙烯酰胺(Acrylamide),亚甲聚丙烯酰胺(N,N’-Methylene Bisacrylamide),TEMED,过硫酸胺(Ammonium Persulfate),PVDF膜公司
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(1)、液体的配制:
①、30%聚丙烯酰胺(隔数月重配):有毒,应注意带口罩和手套。所用称量纸应丢弃。
29g丙烯酰胺加80mlDW于棕色瓶,溶解后补水至
1g NN-亚甲基双丙烯酰胺 ℃保存。
②、 ()
Tris base 溶解后,。补水至100ml, DW 80ml 4℃保存。
③、1Mol ()
Tris base 溶解后,.
DW 35ml 4℃保存。
④、10%SDS
称取电泳级SDS10g于90mlDW中溶解,。如果气温低,可变成白色,需加温使其液体清亮后方可使用。
(5)、10%过硫酸胺(限一周内使用)4℃保存。
。
⑥、TEMED(购买)。 4℃避光保存。
⑦、电泳buffer: (,一般不需调PH值)。常温保存。
可配5×储存液: Base和94g甘氨酸,再加入50ml10%的SDS液,加水补至1000ml即可。
⑧、转移buffer(配1000ml):
39mmol/L 甘氨酸称取甘氨酸29g,Tris Base ,
48mmol/L Tris Base 加到700mlDW中,再加甲醇200 ml,最后补水
%SDS 至1000ml即可。
20% 甲醇
⑨、5×上样buffer:
250mmol/L ()
500 mmol/L DTT
10%SDS
%溴芬蓝
5%甘油
⑩、TBST ()1000ml :
Tris Ba