文档介绍：关于实验十三酶联免疫分析
第1页，讲稿共28张，创作于星期日
一、 ELISA 的发展历程
免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一新型血清学技术。
1966年，Nakane和Avrameas等分别报道
第10页，讲稿共28张，创作于星期日
酶标抗原竞争法示意图
固相载体
抗体
抗原
酶
酶标记抗原
。
，则优先竞争结合抗体，结合
为抗原抗体复合物。
，抗原没有结合的位点，酶标记抗原去占据，则结合为酶标记抗原-抗体复合物。
。
抗原
第11页，讲稿共28张，创作于星期日
四、ELISA的试剂
ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。
1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
3）酶的底物；
4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；
5）结合物及标本的稀释液；
6）洗涤液；
7）酶反应终止液
第12页，讲稿共28张，创作于星期日
免疫吸附剂——固相载体
聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
聚***乙烯--聚***乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。
第13页，讲稿共28张，创作于星期日
第14页，讲稿共28张，创作于星期日
将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被(coating)。
蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，依靠两者的疏水基团之间的作用。
不易吸附的非蛋白质抗原可以间接包被，采用捕获包被法。
脂类物质，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，待溶剂挥发，让脂质自然干固在固相表面。
包被方式
第15页，讲稿共28张，创作于星期日
包被用抗原：
天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。
合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。
第16页，讲稿共28张，创作于星期日
包被用抗体
取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液，须纯化后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。
腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。
在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
第17页，讲稿共28张，创作于星期日
包被的条件
缓冲液：
pH7-8的Tris-HCL缓冲液。
加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时。
包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，需实验选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。
第18页，讲稿共28张，创作于星期日
封闭
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。
封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后续步骤中干扰物质的再吸附。
常用封闭剂：%-%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,可以高浓度使用（5%）。
所有的ELISA固相均需封闭。
第19页，讲稿共28张，创作于星期日
结合物
即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂
酶的催化活性
抗体（或抗原）的免疫活性
含有或少含有游离的抗体（或抗原）
结合物尚要有良好的稳定性。
第20页，讲稿共28张，创作于星期日
结合物用的抗原和抗体
制备结合物时，抗原或抗体在与酶联结时，避免有其他杂蛋白的干扰，最好用层析纯化的抗体，使全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。
在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。
第21页，讲稿共28张，创作于星期日
酶