文档介绍:Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】
实验十一 蛋白质脱盐
实验十一 蛋白质脱盐
(透析和凝胶过滤)
在蛋白质的研究中,经常要进行蛋白质脱盐, Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】
实验十一 蛋白质脱盐
实验十一 蛋白质脱盐
(透析和凝胶过滤)
在蛋白质的研究中,经常要进行蛋白质脱盐,即将蛋白质同其它盐类小分子分离开。蛋白质脱盐的方法很多,各有优缺点。以下仅介绍常用的透析和凝胶过滤方法,可根据实验条件和要求选用。
(一)蛋白质透析
目的
学****透析的基本原理和操作。
原理
蛋白质是大分子物质,不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。在分离提纯蛋白质的过程中,常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。
仪器、试剂、材料
仪器
烧杯;玻棒;离心机;离心管;冰箱;电炉。
试剂
1%***化钡溶液;硫酸铵粉末;1mol/L EDTA;2%NaHCO3。
材料
透析管(宽约,长12-15cm)或玻璃纸;皮筋;鸡蛋清溶液:将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1:20混匀,然后用六层纱布过滤。
操作方法
透析管(前)处理:先将一适当大小和长度的透析管放在1mol/L EDTA溶液中,煮沸10分钟,再在2% NaHCO3溶液中煮沸10分钟,然后再在蒸馏水中煮沸10分钟即可。
取5ml蛋白质溶液于离心管中,加4g硫酸铵粉末,搅拌使之溶解。然后在4℃下静置20分钟,出现絮状沉淀。
离心:将上述絮状沉淀液以1000转/分的速度离心20分钟。
装透析管:离心后倒掉上清夜,加5ml蒸馏水溶解沉淀物,然后小心倒入透析管中,扎紧上口。
将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中,进行透析,并不断搅拌。
每隔适当时间(5-10分钟),用***化钡滴入烧杯的蒸馏水中,观察是否有沉淀现象。
结果处理
记录并解释实验现象。
注意事项
1. 硫酸铵盐一定要充分溶解,才能使蛋白质沉淀下来。
思考题
在透析袋处理过程中, EDTA和NaHCO3起何作用
(二)凝胶过滤
目的
学****凝胶过滤的基本操作技术,了解凝胶过滤脱盐的原理和应用。
原理
凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。目前使用较多的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)和聚丙烯酰***凝胶(Bio-gel-P)等。这些多聚高分子材料,通过适当浓度的交联剂作用即产生分子间横向的交联,形成具有一定孔径的网络结构。当用这类材料制成粒状凝胶颗粒后,颗粒内部就形成一种三维网状结构。这些凝胶材料是高度亲水的,在水溶液里吸水显着膨胀。实际工作中常用每克干胶吸水量(ml)的10倍(G值)表示凝胶的交联度,可根据被分离物质分子的大小和工作目的,选择适合的凝胶型号。
当在柱顶加上分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时,自由通透的小分子可以进入胶粒内部,而受排阻的大分子不能进入胶粒内部。二者在洗脱过程中走过的路程差别较大,大分子只能沿着胶粒之间的间隙向下流动,所经路程短,最先流出。而渗入胶粒内部的小分子受迷宫效应影响,要经过层层