文档介绍：蛋白质浓度测定方法
2021/7/18 星期日
四种古老的经典方法：
定氮法
双缩尿法（Biuret法）
Folin－酚试剂法（Lowry法）
紫外吸收法
新的测定法：
考马斯亮蓝法（Bradford法）
更新的测定方法：
BCA CH-R
H2O
  紫色络合物
2021/7/18 星期日
原 理
双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。
在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540~560nm测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。
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试剂
一 试剂
1．标准酪蛋白溶液（5mg/ml）
NaOH溶液配制： NaOH溶液至1 000ml。
2．双缩脲试剂
（CuSO4 · 5H2O） g酒石酸钾钠（NaKC4H4O6 · 4H2O）于500ml蒸馏水中。在搅拌下加入10% NaOH溶液300ml，用蒸馏水稀释到1升，贮存在内壁涂有石蜡的瓶中，可长期保存。
3．未知蛋白质溶液
γ–球蛋白溶液。
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Folin－酚试剂法（Lowry法）
蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。该化合物在750nm有最大吸收峰。
2021/7/18 星期日
试剂：一：1，4%碳酸钠；2，；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。1和2等体积混合，3和4等体积混合，然后将两液以50：1混合(甲)。当天使用。二：1NFolin--酚试剂(乙)。 方法：标准曲线；试管中加0、、、、（500微克/毫升），加水补足1毫升，平行做两份。按序各加5毫升试剂（甲），摇匀，室温置放10分钟，再依次加入1N（）Folin----酚试剂（乙），摇匀，30摄氏度保温30分钟。然后在分光光度机上比色测定（A750）。
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考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度
考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。
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Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
PROTEIN
+
Amax = 595nm
BLUE
Acid
Coomassie G-250
Protein - Dye
Complex
O
CH
2
CH
3
NH
C
CH
3
CH
3
N
CH
2
SO
3
-
CH
3
CH
2
N
CH
2
CH
2
CH
3
SO
3
Na
+
2021/7/18 星期日
总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）
准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml；Micro -20μg/ml
快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便
经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量
不受样品中离子型和非离子型去污剂影响
检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝
2021/7/18 星期日
基本原理：
碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
2021/7/18 星期日
蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法测蛋白质含量
2021/7/18 星期日
三