文档介绍：目的基因的PCR扩增
及其扩增产物的鉴定分析
综合性设计性实验-8
此实验共包括如下六个部分
第一部分,目的基因选择
第二部分,PCR引物设计
第三部分,PCR实验操作
第四部分,PCR产物电泳鉴定
第五部分,PCR产物测序鉴定
第六部分,目的基因序列变异分析
第一部分,目的基因选择
候选基因简介
在本实验中,有三个候选基因,分别是NGAL,Fascin和Ezrin。
这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达,说明它们在肿瘤的发生发展中起重要的生物学作用。
汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对这三个基因进行了深入研究,在国外杂志上发表SCI收录研究论文20余篇,已形成系列优势。
同学们可查阅相关资料,选择感兴趣的基因来做PCR实验。
NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白,是脂质运载蛋白(lipocalin) 家族的一个成员。
NGAL基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶-9的活性,作为小分子铁配合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外,NGAL作为一种早期标志物还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。
NGAL的mRNA信息在NCBI核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本,包含完整编码区的有BC033089和NM_005564等,编码区长为597 bp,编码198个氨基酸,包含了N端前部长为20个氨基酸的信号肽序列(为核酸序列的1-60 bp)。
NGAL 基因
NGAL核酸编码区序列及其相应的蛋白序列:
前20个AA为信号肽序列
2001年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞系SHEE 和食管癌细胞系SHEEC 互为对照,用cDNA 微列阵进行筛选,用RNA 印迹和RT-PCR 进行鉴定,cDNA 克隆测序后与GenBank 进行BLAST 分析比较。结果表明NGAL 基因在SHEEC中出现显著差异过表达,其cDNA 序列与小鼠24p3、大鼠NRL (neu-related lipocalin) 和人中性粒细胞NGAL 具有较高的相似性。这提示NGAL 基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中可能发挥着重要作用,可能是一种新的癌基因或促癌基因。
A
B
利用cDNA 芯片筛选两种细胞的差异表达基因
A B C
反转录PCR检测NGAL在两种细胞的mRNA水平
C. 100 bp DNA marker
Fascin蛋白的mRNA全长为2767bp,由5‘端非翻译区111bp碱基,3’端非翻译区1174bp碱基,1482bp的全编码序列区和6个PloyA信号肽组成,编码493个氨基酸,分子量约为55kD。
Fascin蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶(ruffles),边缘的丝状伪足(filopodia)、微棘(microspikes)的核心肌动蛋白束中。
以往研究发现,Fascin基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系,如宫颈癌Hela、胃癌AGS、大肠癌LM1215和SW480、胰腺癌BxPC3和T3H4等细胞系中均上调表达。
细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动,癌细胞的转移有密切关系,提示Fascin蛋白可能在细胞迁移、细胞粘附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用。
Fascin 基因
TCGCTCTGGGAGTACTAG
MTANGTAEAVQIQFGLINCGNKYLTAEAFGFKVNASASSLKKKQIWTLEQPPDEAGSAAVCLRSHLGRYLAADKDGNVTCEREVPGPDCRFLIVAHDDGRWSLQSEAHRRYFGGTEDRLSCFAQTVSPAEKWSVHIAMHPQVNIYSVTRKRYAHLSARPADEIAVDRDVPWGVDSLITLAFQDQRYSVQTADHRFLRHDGRLVARPEPATGYTLEFRSGKVAFRDCEGRYLAPSGPSGTLKAGKATKVGKDELFALEQSCAQVVLQAANERNVSTRQGMDLSANQDEETDQETFQLEIDRDTKKCAFRTHTGKYWTLTATGGVQSTASSKNASCYFDIEWRDRRITLRASNGKFVTSKKNGQLAASVETAGDSELFLMKLINRPIIVFRGEHGFIGCRKVTGTLDANRSSYDVFQLEFNDGAYNIKDSTGKYWTVGSDSAVTSSGDTPVDFFFEFCDYNKVAIKVGGRYLKGDHAGVLKASAETVDPASLWEY
Fascin基