文档介绍：关于流式细胞仪简介和使用方法
第1页，讲稿共83张，创作于星期二
第一部分
流式细胞仪标本准备
染色的一般原则及方法
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标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。
管
35um尼龙滤网
DNase
第15页，讲稿共83张，创作于星期二
将样本置于皮氏培养皿，加15ml BSA-PBS，将样本切 成1mm3大小，用镊子将其分离；
HBSS或PBS洗清
加入10ml无Ca、% % DNase 1的HBSS；
37ºC摇床上孵育15~60分钟，视样本类型而定；
操 作
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用5ml的吸样管反复吹打，制成单个细胞悬液；
使用35um滤网过滤，300g离心5分钟；
用PBS或细胞培养液重悬样本；对于某些样本过滤后仍有小块组织，重复第5步获取细胞，重复第7步；
%胰酶、%DNase 1不含Ca、Mg的HBSS重悬， 37ºC孵育一段时间加入1%BSA或5%FBS，灭活酶活性。
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细胞培养
许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。
准备单细胞悬液
：
%r EDTA,pH
% 的胰酶
10%血清的培养液
：
a. PBS洗涤细胞；
b. %有胰酶，37ºC处理2~8分钟；
c. 倒置显微镜下观察，至大部分细胞脱落悬浮后，加入含10%血清的培养液。
d. PBS液洗涤细胞，最后配成终浓度为1×106/ml 的细胞悬液。
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样 本 处 理
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抗体染色一般方法
外周血白细胞分析：100ul全血
血小板分析：1~5ul全血（根据样本血小板数量）
红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使用）
骨髓：100ul
其他样本，计数后决定使用体积
目标细胞数量及检测终浓度：1×106/ml
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细胞计数方法
传统手工计数：耗时、准确度差
流式细胞仪计数：
BD，Coulter仪器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，？
partec仪器:最为精密的细胞计数器，直接报告细胞浓度
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反应体积
样本中加完抗体后， 1×106细胞反应体积应不小于100ul。
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抗体染色
最为普通的抗体染色原则：
1×106细胞对1 ug 抗体（抗体供应商所推荐使用单位），此浓度90%处于过饱合状态
精确使用：滴定抗体，抗体对于抗原恰达到饱合浓度
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SPECIFIC
ANTIBODY
NON-SPECIFIC
ANTIBODY
CONCENTRATION
AMOUNT BOUND
抗体滴定原理
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流式细胞仪抗体滴定方法
3
3 µg
s/n =
1 µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
auto
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6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
60
Dilution
Signal to Noise
TITER
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孵育、溶血、固定
抗体孵育：室温下避光15分钟（某些情况下如：细胞内因子检测需冰育）
溶血：如样本含中有红细胞需溶血（见下页）
样本溶血后需立即上机检测，固定后可放置较长时间
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白细胞保护型溶血剂Cal-Lyse(其中已含细胞固定剂)：
1，100ul外周血，加入100ul溶血剂
2，混匀后，室温下孵育10分钟
3，加入2ml蒸馏水，混匀后室温下孵育10分钟
4，根据实验需要，免洗直接上机检测或400g离心10分钟后PBS重悬
优