文档介绍：质粒DNA的提取和纯化
郑敏
生化与分子生物学系
分子生物学
从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系,如遗传信息的传递,基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能,以及细胞信号的转导等。
基因工程
移液器和EP管
质粒
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧核糖核酸物质。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
能稳定地独立存在于染色体外,并传递到子代,一般不整合到宿主染色体上。
现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的,常含抗生素抗性基因,是重组DNA技术中重要的工具。
分类:
单拷贝质粒;
多拷贝质粒;
紧密控制型;
松弛控制型;
质粒DNA的提取方法
碱裂解法;
煮沸裂解法;
酚氯仿抽提法;
概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理。
基本思路
培养细菌使质粒扩增;
收集和裂解细菌;
分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA,根据实验所需)
电泳检测;
碱裂解法的基本原理
十二烷基磺酸钠(SDS) 可使细胞膜裂解。
经SDS处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circularDNA,DNA)的两条链不会相互分开。
当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。