文档介绍：背景
尿酸氧化酶（Urate Oxidase, ）,又称尿酸酶（Uricase ）是生 物体内喋吟降解代谢途径中的一种酶， 大部分生物在喋吟的代谢过程中产生
尿酸，而尿酸酶能催化尿酸氧化为尿囊素。 许多物种中均发现有尿白质溶
液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质， 于是蛋白质分子周围的水化膜层
减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，
蛋白质表面电荷大量被中和， 更加导致蛋白溶解度降低， 使蛋白质分子之间
聚集而沉淀。
1器材：超声破碎仪，离心机
2 试剂：超声缓冲液： mol/L , pH Tris-Gly （ Tris, ,定容至 500ml ,定容前调 。）
发酵菌液4000 rpm X25 min离心，收集湿菌体，每 1 g菌体加入15 ml超声缓冲液。超声机粉碎破壁，功率 300 w ,工作时间5 s,间隔时间5 s,共90个循环。
取悬于超声缓冲液的菌体，10000 g X10 min 离心，上清加 （NH4）2SO4 至 40% 浓度，静置 1 h , 12000 g X15 min 离心，沉淀用 3 ml mol/L 的 pH Tris- Gly 悬溶；上清加（NH4）2SO4 至 70% 浓度， 静置1h , 12000 g X15 min 离心，沉淀保留。
.量得发酵菌液体积
.量得发酵所得湿菌体重量
.超声破碎离心后测上清 OD280 ,体积及留样1ml
实验二尿酸氧化酶柱纯化
学****根据蛋白质所带电荷，选择离子交换树脂进行蛋白质的分离纯化。
离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。 带有正电荷
的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。 离子交换层析可
以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的 pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质， 所以这类蛋白质被留在柱子上， 然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施， 将
吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。 结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。 反之
阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质， 结合的蛋白可以通过逐步增加洗
脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的 pH值洗脱下来。
Sepharose 是表示以琼脂糖为基质的胶， Sepharose Fast Flow 分的
DEAE, CM, Q, SP就是在 Sepharose 分别偶联上 二乙基氨乙基，
竣***，三甲***基，磺丙基，作为弱阴，弱阳，强阴，强阳四种离子交换填 料。
.器材：
填料：DEAE-Sepharose .;核酸蛋白仪；紫外分光光度计；梯度混合仪； 分步收集器
.试齐I」：
透析液：20 mmol/L , ， g硼酸溶于3000 ml蒸储水。
平衡液：20 mmol/L 硼酸盐缓冲液，。
离子交换洗脱液： mol/L NaCl , 20 mmol/L 硼酸盐缓冲液；2 mol/L
NaCl , 20 mmol/L 硼酸盐缓冲液（）。
将硫酸镂纯化后沉淀用 20ml , , 20 mmol/L 硼酸盐缓冲溶解， 并透析过夜。透析后测量体积，测 OD280及留样1ml。
配制20 mmol/L 硼酸盐缓冲液 500 ml ,。采用 上述溶液平衡层析柱，上样后以 0〜 mol/LNaCl , 20 mmol/L 硼酸盐 溶液进行梯度洗脱，再以 2 mol/L NaCl 进行柱再生，流速 2 ml/min ,收 集尿酸酶活力峰。
,
OD280
，并绘制尿酸酶的洗脱曲线。
实验三尿酸氧化酶的鉴定
学****通过SDS-PAGE鉴定蛋白质分子量及纯度
聚丙烯酰***凝胶是由丙烯酰*** （简称Acr）和交联剂N, N'—亚***双丙
烯酰***（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，
并以此为支持物进行电泳。 聚丙烯酰***凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电
荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带， 如
果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质， 蛋白质样品电泳后， 就应只分离出一
条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键， 并按一定
的比例和蛋白质分子