westernblot详解及问题分析.ppt

文档介绍：蛋白质免疫印迹技术及
常见问题分析
张绍进
Western Blot简介
Western Blot一般流程
Western Blot常见问题分析
Western Blot 简介:
印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western Blot 基本原理
Western Blot 优点
高分辨率的电泳技术
特异敏感的抗原-抗体反应
1-5ng中等大小的靶蛋白
Western Blot应用
目的蛋白的表达特性分析
目的蛋白与其它蛋白的互作
目的蛋白的组织定位
目的蛋白的表达量分析
Western Blot 流程
蛋白样品的制备
SDS-PAGE
转膜
封闭
一抗杂交
二抗杂交
底物显色
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白
水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。
有机溶剂提取法
对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
蛋白样品的提取
蛋白样品的定量
目前常用比色法测定样品蛋白的含量:Bradford法(考马斯亮蓝法)、Lowry法(Folin-酚试剂法)、 BCA法等。但各有优缺点,大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作,测定样品浓度。
蛋白质浓度测定的各种方法汇总:
http://bbs./thread-23639-1-
蛋白样品的变性
2×SDS-PAGE上样缓冲液:
DTT可临用前以1:4比例混合加入,亦可全部配好分装,-20℃冻存。
按1:1比例与蛋白质样品混合,95~100℃加热5~15min,冰上冷却后再上样,上样量一般为20-25μl,总蛋白量20~50μg。
1M Tris-HCl()
10 ml
1M DTT
20 ml
SDS
4 g
甘油
20 ml
溴酚蓝
g
总体积
100ml
100mM Tris-HCl()
200mM DTT
4%SDS
%溴酚兰
20%甘油
ddH2O