文档介绍：黄芩苷抗金黄色葡萄球菌α-溶血素作用机制的确证
指导教师:陈志宝
班级:生物技术
姓名:周薇
学号:20094081129
简介
us aureus,(简称为金葡菌)是常见的革兰氏阳性致病菌,是极其重要的人兽共患病原体。
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本研究应用定点残基突变和荧光淬灭试验验证黄芩苷与α-溶血素的结合位点。通过将α-溶血素氨基酸序列中的Tyr148、Pro151和Phe153突变为丙氨酸(Ala),表达和纯化野生型α-溶血素及突变体α-溶血素,应用荧光淬灭试验测定结合常数,结果表明,突变后的α-溶血素与黄芩苷的结合明显降低,结合常数大小为野生型> F153A > P151A > Y148A。通过脱氧胆酸诱导的寡聚化和SDS-PAGE验证了黄芩苷对α-溶血素七聚体形成的影响。
材料与方法
菌株及载体:金黄色葡萄球菌8325-4 大肠杆菌DH5α、BL21
主要试剂:PBS缓冲液 Amp 贮液 IPTG 贮液离子交换缓冲液(Buffer A) 离子交换缓冲液(Buffer B) 5 mM脱氧胆酸钠溶液
仪器:普通PCR扩增仪电泳系统凝胶成像分析系统超声波细胞破碎仪 Akta purifier 恒温水浴锅超净工作台生化培养箱恒温摇床紫外分光光度计制冰机高速离心机
材料与方法
方法:
1 hla及hla突变体的引物设计
2 基因组提取
3 hla-pGEX-6P-1载体的构建和原核表达
4 QuikChange法对hla基因进行定点突变
5 Hla重组蛋白和突变蛋白的大量表达和纯化
6 荧光淬灭试验
7 SDS-PAGE观察黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的Hla寡聚体形成的影响
8 溶血试验
结果
1 hla-pGEX-6P-1载体的构建和原核表达
金黄色葡萄球菌hla基因的克隆及序列分析
重组Hla的可溶性分析
1 PCR扩增得到的hla基因电泳图 2 菌落PCR鉴定电泳图 3 重组载体双酶切鉴定电泳图
结果
4不同温度诱导时Hla的表达情况 5 不同温度诱导下Hla的表达形式
结果
uiQkChange法对hla基因进行定点突变
6野生型hla基因序列和突变型hla序列
结果
重组Hla蛋白和突变Hla蛋白的纯化
7亲和层析收集蛋白电泳图
8 Hla在Resource S离子交换柱上的色谱图
9 Resource S离子交换后Hla电泳图
10 Hla在Superdex 75柱的色谱图
11 过Superdex 75柱后Hla电泳图
结果
Hla与黄芩苷结合常数
12 黄芩苷与野生型Hla和两种突变体Hla相互作用的荧光光谱
结果
SDS-PAGE观察黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的Hla寡聚体形成的影响
13 黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的Hla
寡聚体形成影响
14 黄芩苷、汉黄芩苷和野黄芩苷阻碍Hla七
聚体形成能力的比较