文档介绍：第四章 基因操作中大分子的分离和分析
第一节 DNA的分离、检测和纯化
第四章 基因操作中大分子的分离和分析
一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化
1. 碱裂解法提取质粒DNA
2. 通过试剂盒分离纯化质粒DNA
糖在水溶液中的溶解温度 （melting point）很低，在 65 ℃以下；当温度降低到 20-30 ℃时凝结成固形物。
如果需要分离特定的 DNA 片段，可用低熔点琼脂糖凝胶进行分析，然后切割带有目标 DNA 的琼脂糖凝胶块，加入适量缓冲液，加热到 60 ℃，凝胶溶化， DNA 进入水溶液中，最后通过苯酚 / ***仿抽提和乙醇沉淀获得纯化的 DNA 片段。
2．透析袋电洗脱法
将含有目标DN***段的琼脂糖凝胶块切割下来，放在透析袋中，置于电泳缓冲液中电泳， DNA 将从凝胶块中“跑”出来。常用于回收 5kb 以上的 DNA 片段。
3．Glass Milk （bead）结合法
琼脂糖凝胶在 3 倍体积的 3M NaI 溶液作用下于 55 ℃会溶化，从而将 DNA 释放到水溶液中；在这样的高盐浓度下，有一种硅珠 可特异性吸附 DNA 。当硅珠吸附 DNA 后，通过离心的方法很容易对硅珠进行洗涤，然后用水或低盐缓冲液可从硅粒中将吸附的 DNA 洗脱出来。
4．Qiagen 纯化柱
第二节 RNA的分离、检测和纯化
第四章 基因操作中大分子的分离和分析
一、控制潜在的 RNA 酶的活性
1．溶液和用具的去 RNA 酶处理
用 % 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水浸泡后再灭菌，或购买无 RNA 酶污染的用具。
对于电泳用具最好使用专用的，不要用于其它分析，在使用之前用洗涤剂洗涮干净，再用 3%H 2O2 和 % DEPC 处理的水浸泡，清洗干净。
2．RNA 酶抑制剂的使用
为了进一步防范 RNA 降解，一般在 RNA 样品和 RNA 反应中加入 RNA 酶抑制剂，现在应用较多的是蛋白类抑制剂，如人胎盘 RNase 抑制剂。
除此之外，还有氧铜核糖核苷复合物（完全抑制剂，且抑制体外翻译）和硅藻土（吸附 RNase 吸附剂）。
二、RNA的抽提和纯化
1．酚 - 异硫氢酸胍抽提法
TRIZOL 试剂是使用最广泛的抽提总 RNA 的专用试剂
由 Gibco 公司根据酚 - 异硫氢酸胍抽提法设计，主要由苯酚和异硫氢酸胍组成
对任何生物材料的 RNA 提取，首先研磨组织或细胞，或使之裂解；加入该试剂后，可保持 RNA 的完整，同时进一步破碎细胞并溶解细胞成分；加入***仿抽提，离心，水相和有机相分离；收集含 RNA 的水相；通过异丙醇沉淀，可获得 RNA 样品。
组织RNA的提取：
把液氮冻存的组织放到冰冻的碾钵中碾碎，加入适量的Trizol 试剂（1mL/100mg组织）裂解组织，冰上放置5 min。
吸入离心管中，加入***仿( Trizol)，冰上放置5 min。
10 000×g离心10 min，吸取上清于另一离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置10 min。
10 000×g离心15 min，去上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温风干，加DEPC处理的双蒸水溶解。
2．硅胶膜纯化法
RNeasy 试剂盒是由 Qiagen 公司设计
其设计思路与 DNA 的分离纯化思路相似
含有目标核酸的细胞破碎液通过硅胶膜时，核酸吸附在硅胶膜上，从而与其它细胞成分分开
然后在低盐浓度下核酸可从硅胶膜上洗脱出来。
三、mRNA的纯化
mRNA 的纯化主要是针对真核生物而言的
由于真核生物 mRNA 的 3‘ 端有一个 poly（A） 尾
可用亲和层析的方法纯化
有许多类型的商业化层析柱可用于 mRNA 的纯化。
四、RNA的电泳检测
RNA 的浓度和纯度可通过测试其OD260 来判断
OD260 为 1 时相当于浓度为 40 mg/ml 。
要直观地观察 RNA 的存在以至于分析，可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰***凝胶电泳来完成。
1．琼脂糖凝胶电泳
通过琼脂糖凝胶电泳进行 RNA 分析和 DNA 分析的原理是类似的。不同的是， RNA 分析是在变性的条件下进行的。常用的变性剂为甲醛，也可使用氢氧化******和乙二醛 - 二***亚砜（DMSO）。
2．聚丙烯酰***凝胶电泳
聚丙烯酰***凝胶电泳主要用来分析小分子量的单链核酸，如小分子量 RNA 寡核苷酸、DNA 序列分析等。其变性条件可用加热方式，或使用尿素等变性剂。
电泳检测结果有三条清晰的rRNA 带：28S，18S和5S，表明RNA未降解
Total RNA
第三节 分子杂交
第四章 基因操作中大分子的分离和分析
Sout