文档介绍：关于蛋白质的定性定量分析
第1页，讲稿共59张，创作于星期三
蛋白质定性分析 (qualitative analysis)
确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质
蛋白质定量分析 (quantitative an合，形成稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量
第19页，讲稿共59张，创作于星期三
优 点
检测敏感性高
缺 点
蛋白质发生不可逆的变性
终产物稳定
巯基试剂和去垢剂干扰
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第二节 蛋白质相对分子量测定
分子量测定 (molecular weight, MW)
排阻层析
沉降平衡超速离心
动态弹性光散射
孔径梯度电泳
质谱 (ESI-MS)
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一、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量
1. 不连续系统原理
2. SDS-PAGE凝胶的制备
制备分离胶
制备浓缩胶
加样
装板
电泳
卸板并进行凝胶染色
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3. SDS-PAGE基本原理
SDS
影响迁移率的因素
十二烷基硫酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfate)
十二烷基磺酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfonate )
第23页，讲稿共59张，创作于星期三
SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结合比例为 SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异
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SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的荷质比，因此在SDS-PAGE中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系
Watch SDS-PAGE原理
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4. SDS-PAGE测定分子量的操作
标准品的选择及处理
待测样品的制备
电泳分离及染色
相对迁移率的计算
Watch SDS-PAGE操作
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Analysis for SDS-PAGE electrophoresis
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5. 注意事项
选择合适的胶浓度
样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉
淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去
SDS与蛋白质之间的结合程度
蛋白质的分子量范围 15～200 KD之间
二硫键是否完全被还原
溶液中SDS的浓度
溶液的离子强度
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多亚基蛋白质分子量检测
用其它方法测定分子量进行参照
SDS和巯基乙醇
SDS-PAGE测定的准确性
电荷异常或构象异常
带有较大辅基的蛋白质
某些结构蛋白
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二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量
1. 基本原理
2. 凝胶过滤测定分子量的操作
分子筛效应
洗脱体积与相应分子量的关系
装柱
平衡
加样
平衡
洗脱
收集样品并计算Ve
绘制标准曲线
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3. 注意事项
柱床表面不能干燥
凝胶的选择
Sephadex 溶胀
G值的意义
凝胶柱的再生与保存
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第 三 节
等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点
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等电点 (isoelectric point, pI)
两性电解质性质
支持介质 (supporting media)
Figure of IEF
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+
–
pH 3
pH
pH 10
+
–
pH 3
pH
pH 10
+
–
pH 3
pH
pH 10
+
–
pH 3
pH
pH 10
Isoelectric Focusing
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