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实时荧光定量pcr实验报告
篇一：实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR的基本原理
理论上，PCR过程是按照2n （n代表PCR循TaqMan探针的性能：在探针结构完整的情况下用特定的波长激发报告基团，由于报告基团与淬灭基团的空间位置很近，因此报告基团能够通过FRET （Fluorescence Resonance Energy Transfer）将接受的能量转移到淬灭基团，使后者以发射荧光或热量的方式释放能量，而报告基团并不发射特
定波长的荧光信号。
TaqMan探针法工作原理：
?变性（95° C）：模板dsDNA充分解链；
?复性、延伸、酶切降解（60° C）： 1,探针与靶序列结合；上、下游引物与靶序列结合；
3,上、下游引物在Taq酶的作用下合成互补链（5' — 3’聚合功能）；4,当上游引物延伸到TaqMan探针的5’端时，延伸不能继续，此时Taq酶发挥5’一3’外切功能将探针逐一水解并继续向前延伸直至完成互补链的合成；
?荧光信号的检测：由于TaqMan探针被水解，报告基团在受到激发后不能再通过FRET作
用将接受的能量转移给淬灭基团，因此可以检测到报告基团特定波长的荧光信号，起始模板浓度越高荧光信号越强。
与染料法相比TaqMan探针法的优点：1，实验的特异性得到了提高；2,对探针的5’端采用不同的荧光标记就可以进行 Multiplex QPCR。
与染料法相比TaqM
an探针法的缺点：1，探针的使用提高了实验成本；2，探针的使用需要设计及优化。
确定样品起始模板拷贝数的2类方法
绝对定量
采用绝对定量的方法需要使用标准品（已知起始拷贝数的样品）建立标准曲线，建立Ct值与样品起始模板拷贝数的对数之间的线性关系，从而通过实验后样品的Ct值得出起始模板量。
标准品的种类：含目的基因的质粒（经酶切线性化处理，其中的插入片段必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得到）、PCR扩增产物（经纯化，必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得到）、化学合成的寡聚核苷酸、cDNA、gDNA等，前2种标准品使用较为广泛。标准品的定量：UV A260、荧光分光光度检测等。
为了使实验最终得到的Ct值之间具有可比性，必须进行归一化的处理：1，对各样品进行
细胞计数，使各样品的起始细胞数一致（可操作性不强，尤其是针对组织、肿瘤等样品）；2,对纯化后得到的总RNA 进行定量，使各样品进行RT-PCR时加入的RNA用量一致。相对定量
与绝对定量不同，相对定量不关心每个样品中目的基因表达产物（mRNA）的具体拷贝数，而关注目的基因在不同的细胞类型、不同的发育周期等条件下不同的转录效率，即基因的差异化表达。就研究目的而论，该方法比绝对定量的应用范围更广泛、更符合研究的目的。某目的基因在样品与对
照品间表达差异倍数的计算公式如下：
公式说明：
:目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数；
GOI ：目的基因(Gene of Interest)；
Norm:内参基因(Reference Gene，Normalizer，House Keeping Gene)
Eff： PCR扩增效率，分子部分为目的基因扩增效率，分母部分为内参基因的扩增效率；使用该公式时，需要通过实验分别确定目的基因与内参基因的扩增效率然后代入公式进行计算；如果目的基因与内参基因的扩增效率都接近于 100%且相差小于5%，也可将PCR扩增效率默认为100%，这样公式就简化为2- △△"。
?为什么需要设立内参基因？
如果仅仅比较目的基因的^ Ct是不能准确反映样品间目的基因的表达差异的，最主要是受到3个变量的影响：1，样品处理时不同的纯化得率；2, RT-PCR过程中不同的逆转录效率；3, QPCR反应体系中不同的cDNA加入量。由于上述 3个变量在样品间都很难控制在相同的水平上，因此需要引入内参基因来矫正上述变量进行归一化处理，使得所有样品目的基因表达水平的比较是在相同的水平上进行的，这样得
出的结果才具有可信性与良好的重复性。（注意：内参基因的（1+Eff^Ct）位于分母的位置，进行除法的运算。）
?如何选择内参基因？符合什么标准的基因可以作为内参基因？
由于上述内参基因的用途，因此内参基因的选择必须满足以下3个条件：1,在不同的细胞、组织中具有恒定的表达；2,在不同的细胞周期、发育周期中具有恒定的表达；3, 在不同的实验状态下具有恒定的表达。内参基因的ACt一般小于2（即小于1倍的表达差异），一般采用的内参基因