文档介绍:实验一、质粒DNA的提取及检测
【实验目的】
1、 掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤
2、 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术
3、 学会PCR操作的基本技术
第一部分质粒DNA的提取
一、 实验原理:
碱裂解法提取质粒实验一、质粒DNA的提取及检测
【实验目的】
1、 掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤
2、 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术
3、 学会PCR操作的基本技术
第一部分质粒DNA的提取
一、 实验原理:
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差 异来分离它们。〜,线性的DNA双螺旋结构解开 而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此 相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。, 共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染 色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状 结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下 来而被除去。
二、 仪器与试剂
1、 仪器 恒温摇床、台式离心机
2、 试剂 溶液I、溶液II、溶液III、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿
三、 实验步骤
1、 将2mL含相应抗生素(Amp:50gg/mL)的LB液体培养基加入到试管中,接入含pUC19 质粒的大肠杆菌,37°C振荡培养过夜。
2、 ,4000r/min离心2min。
3、 吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。
4、 将细菌沉淀悬浮于100gL溶液I中,充分混匀,室温放置10 min。
5、 加200gL溶液1(新鲜配制),盖紧管皿,混匀内容物,将离心管放冰上5min。
6、 加入150应溶液I (冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀。冰上放置15min。
7、 12000r/min,离心15min,将上清转至另一离心管中。
8、 向上清中加入等体积酚:氯仿(1: 1)(去蛋白),反复混匀,12000r/min,离心5min, 将上清转移到另一离心管中。
9、 向上清加入2倍体积无水乙醇,混匀后,室温放置5〜10min。12000r/min,离心5min。 倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。
10、 用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或空气中干 燥。
11、 加20gLTE缓冲液,其中含有20gg/mL的胰RNA酶,使DNA完全溶解,-20C保存。
第二部分琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、 实验原理:
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应°DNA分子在高于等电点的 pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数 量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定 的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。 具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。DNA分子的迁移速 度与相对分子质量的对数值成