文档介绍：关于酶联免疫吸附测定法
第1页，讲稿共31张，创作于星期三
复杂生物体系中生命物质的化学测量是揭示生命奥秘的重要手段，在食品检验、疾病诊断和预防的过程中也日益凸现其重要作用。
经典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、简单的吸光光光度计（酶标仪）加以测定。
其方法简单，方便讯速，特异性强。
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二、酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应.
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酶
底 物
显色反应
测定波长
辣根过氧化物酶
邻苯二*** 四甲替联苯*** 氨基水杨酸 邻联苯甲*** 2,2‘-连***基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
492
460
449 425 642
碱性磷酸酯酶
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
黄色 红色
400 500
葡萄糖氧化酶
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
黄色 深蓝色
405
420
β-Ｄ－半乳糖苷酶
***伞***基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
荧光 黄色
360,450 420
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ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法
（二）间接法
（三）竞争法
（四）双位点一步法
（五）捕获法测IgM抗体
（六）应用亲和素和生物素的ELISA
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（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
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获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相
载体连接形成固相抗体
洗涤除去未结合的
抗体及杂质
加入封闭蛋白溶液以封闭载体
表面残留的蛋白结合位点
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成
固相抗体－抗原复合物
洗涤除去其他
未结合的物质
加酶标抗体生成
抗体—待测抗原—酶标记抗体
的复合物
彻底洗涤
未结合的
酶标抗体
加底物进行
酶催化反应
根据颜色反应的
程度进行该抗原
的定性或定量测定
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间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
（二）间接法
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包被固相载体:
用已知抗原包被
固相载体
加待检标本:
使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
加酶标抗抗体:
与固相载体上抗原抗体
复合物结合；洗涤，除去
未结合的酶标抗抗体
加底物
显色
根据颜色反应的程度进行
该抗原的定性或定量测定
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（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体 。
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用已知特异性
抗体包被
固相载体
测定管加待测抗原和
一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原
与固相抗体直接结合
分别洗涤
除去未结合
的成分
加底物显色
分别测定两管的吸光度值，
根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
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对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。
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特点一：灵敏性
该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶。众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。
例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml 。
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特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。
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