文档介绍：单细胞测序技术流程及其应用
摘 要:细胞是生命活动的基本单位,是人们的重点研究对象。阐释生命活动的规律,就必须要对细胞的通讯、免疫、复制、调节等活动的生化途径进行深入研究。不同细胞之间存在“异质性”,但传统上的研究方法无法突破单细胞测序技术流程及其应用
摘 要:细胞是生命活动的基本单位,是人们的重点研究对象。阐释生命活动的规律,就必须要对细胞的通讯、免疫、复制、调节等活动的生化途径进行深入研究。不同细胞之间存在“异质性”,但传统上的研究方法无法突破“单细胞”这一条件的限制,因此实验结果反映的更是多个细胞之间的平均结果,所以有些疾病如“癌症”无法被精确地检测出来,相反单细胞分析可以更精确地了解每个细胞之间的表达情况,将会应用在很多领域例如:神经生物学、干细胞生物学等方面,本文将归纳单细胞分析的基本流程,并列举些许应用实例。
关键词:单细胞测序;应用;流程
1 绪论
传统上的细胞分析方法局限于细胞群,这种方法存在一定局限性,细胞群所转录或表达的产物代表这个细胞群平均水平,然而低分子量的物质却难以检测到,因此我们所得出的结论就不能应用于单个细胞,就不能解释很多现象,例如:同一种药物施加于同一组织的相邻的细胞具有不同的功效。单细胞分析将研究对象转移至单个细胞,更适合于细胞的‘异质性’研究,其在神经生物学、医药方面、微生物、发育生物学等各个领域具有广泛的应用前景。
2 基本流程
分离
分离、获得单细胞是单细胞测序的第一步,现在有很多分离单细胞的技术,例如:显微操作技术、激光捕获切割技术、荧光激活细胞分选、微流控技术等等。[2]荧光激活细胞分选的优点是准确度高,通量大,缺点是需要大量的悬浮细胞作为材料;显微操作技术优点是操作方便成本低,缺点是通量低并且容易损害细胞;激光捕获切割优点是保护要捕获的细胞,不破坏细胞周围组织结构,缺点是价格高昂;[3]梯度稀释法的优点是价格低廉,但是容易出现分离错误。
扩增
(1)单细胞全基因组扩增技术。首先,将所获得的单细胞溶解,获得微量DNA,其次利将所得到的微量DNA进行高效扩增,从而获得高度覆盖的基因组。其中,扩增技术分为两类,有如‘兼并核苷酸引物技术’这类基于PCR的全基因组扩增技术,以及如:‘多重置换扩增技术’这类不基于PCR的全基因组扩增技术。不同的扩增技术适用于不同的测序、分析技术。
(2)单细胞转录组扩增技术。将单个细胞的mRNA通过PCR逆转录为cDNA,再进行扩增,从而获得大量的转录组。SMART是现今最常用的一种方法,当然还有其他诸如:Phi29聚合酶扩增技术、STRT技术等转录组扩增技术。
测序
单细胞测序涉及到两个方面:转录组和基因组,测序过程中针对单个细胞的DNA和RNA分别进行分析与比较,从而找到基因组和转录组之间的差异与变化。[7]
3 应用
单细胞分析技术在肿瘤研究方面的应用
肿瘤细胞存在异质性,从细胞群的角度观察肿瘤细胞,无法找出不同细胞之间的差异,从而会限制对肿瘤细胞的研究。通过单个肿瘤细胞的测序,我们可以研究肿瘤发生、新陈代谢的过程,同时认识各种肿瘤细胞之间及个体之间存在差异的起因和肿瘤疾病产生的根源所在。