文档介绍：WB操作步骤-自己整理
Western Blot 相关实验方法与试剂〔湿转法〕
人工肝实验室学****姚瑶
目的蛋白提取：
〔1〕单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、倒掉细胞培养液，参加Hanks液进行转膜。
〔四〕转膜：
配制1×转膜缓冲液〔现配〕。一般配制成10×转膜缓冲液储存。需要时配制成1×现用。PVDF膜需用甲醇激活(15s)，注意戴手套、赶走气泡、胶与膜的位置、膜的正反面。
放置顺序为：海绵--滤纸2层—PVDF膜—凝胶--滤纸2层—海绵。〔大小：凝胶>滤纸>PVDF膜〕
〔五〕免疫反响：
1、5%脱脂奶粉封闭，4℃过夜。
2、一抗孵育。
3、洗膜：PBST/TBST洗膜3次，10min/次。
4、二抗孵育。
5、洗膜：PBST/TBST洗膜3次，10min/次。
〔六〕显色：
将HyGLO试剂A 750ul与试剂B 750ul混合后，均匀地滴于膜正面，约1min后，抖掉膜上液体，并吸干后显色。
在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时参加HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比拟明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两局部，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。
丽春红染色剂是一种阴离子重氮染料，由重氮氨基偶氮苯二磺酸〔diazotized 4-amino-1,1’-azobenzene-3,4’-disulfonic acid〕和萘酚二磺酸〔2-naphthol- 3,6-disulfonic acid〕耦合到四钠盐上。其分子式C22H12N4Na4O13S4，。最大吸收光谱为520nm波长。带负电荷的丽春红分子与正电荷的蛋白质氨基基团结合，也可以非共价键形式与蛋白质非极性区域结合。
丽春红染色溶液是染料丽春红与蛋白质氨基基团的结合并显示红色蛋白条带，快速、敏感、可逆地检测PVDF膜、***纤维素膜、醋酸纤维素膜上的蛋白成分。丽春红染色溶液性能长期稳定，着色清晰灵敏，可检测250ng以上的蛋白。
丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗去除。
使用方法：
1．取适量丽春红染色液，用去离子水10X稀释备用，染色液的用量，依膜的大小而定，浸没膜即可；  
2．将PVDF膜、***纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染色液中，振荡5-10分钟或更长时间；
3．取出印迹膜，用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，可出现清晰条带，记录结果； 
4．用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，每次3-5分钟，去除丽春红，进行后续的Western检测。
Western Blot 相关试剂
试剂名称
说明
Hanks液
细胞漂洗液
胰酶
提取蛋白
PBS溶液
缓冲液、洗涤液
细胞裂解液RIPA
裂解细胞
去离子水
配制别离胶、浓缩胶
聚丙烯酰***
配制别离胶、浓缩胶
Tris-HCl
配制别离胶、浓缩胶
Tween 20
配制别离胶、浓缩胶
十二烷基硫酸钠〔SDS〕
配制别离胶、浓缩胶
过硫酰***〔AP〕
配制别离胶、浓缩胶
四***乙二***〔TEMED〕
配制别离胶、浓缩胶
β-巯基乙醇
翻开蛋白双键
上样缓冲液
内含溴酚蓝
微量加样器
加样
PVDF膜
甲醇
活化PVDF膜，配液
封闭液〔脱脂奶粉〕
封闭蛋白
PBST/TBST
洗涤液
HyGLO试剂
ECL发光法显色
甘氨酸
配制电泳液也转膜液
丽春红染色剂
检测PVDF膜上蛋白成分
蛋白电泳仪
WB转膜仪
切胶板
附1：溶液配制
胰酶： 胰酶 加PBS至100ml。
30%聚丙烯酰***：聚丙烯酰***29g+双丙烯酰***1g 见蒸馏水至100ml
Tris-HCl：
M ： 36g Tris 加水至200ml 加HCL滴定至pH 。
M ： 24g Tris 加水至200ml 加HCL滴定至pH 。
4、10% AP： AP 1g 加蒸馏水至10ml