文档介绍：文件编码（TTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-0089）
引物的合成原理
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目前引物合成基本采用固相亚磷酰***三酯法。DNA合成仪有很多种,主要都是由ABI/PE公司生产，无，简单的做法是：加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul,加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm,。
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答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用
引物长度要求
纯度级别要求
一般PCR扩增
<45base
OPC
>45base
PAGE
诊断PCR扩增
<40base
OPC,PAGE
DNA测序
20base左右
OPC
亚克隆，点突变等
根据实验要求定
OPC,PAGE，HPLC
基因构建（全基因合成）
根据实验要求定
PAGE
反义核酸
根据实验要求定
PAGE
修饰引物
根据实验要求定
PAGE,HPLC
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答：引物越长，出现问题的概率就越大。我们合成过120base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。
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答：根据实验目的确定。一般PCR扩增，2OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10OD。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长,最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
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答：实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰***凝胶进行电泳。-，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB染色或银染方式染色。
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答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V(微升)=OD数*（乘）33*（乘）*（乘）20000/(除)引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
注意：1OD260=33ug/ml.
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答：引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm=+[Na+]+(%GC)–600/size
公式中，Size=引物长度。
Tm的定义：Tm=Temperatureatwhich50%,likeformamideorurea,Tmwilldependon3majorparameters:Thesequence:aGC-:higholigonucleotideconcentrationsfavorhybridformation,:highionicstrengthresultsinahigherTmascationsstabilizetheDNAduplexes.
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