文档介绍：柱离心法小量提取质粒 DNA 及 DNA 的琼脂糖凝胶电泳
实验目的和要求：
1、了解质粒 DNA 的应用，并学习用柱离心法小量提取质粒 DNA。
2、掌握 DNA 琼脂糖凝胶电泳的方法。
实验原理：
质粒是细菌中独立于染色体之外柱离心法小量提取质粒 DNA 及 DNA 的琼脂糖凝胶电泳
实验目的和要求：
1、了解质粒 DNA 的应用，并学习用柱离心法小量提取质粒 DNA。
2、掌握 DNA 琼脂糖凝胶电泳的方法。
实验原理：
质粒是细菌中独立于染色体之外的较小的环状双链DNA，它通常携带某种 药物（如氨苄青霉素，卡那霉素，链霉素，四环素等）的抗性基因，具有独立的 复制原点，并且具有较高的拷贝数（从几个到几百个不等）。
柱离心法首先用碱使大肠杆菌裂解，并使其中的DNA （包括质粒及细菌的 染色体DNA）全部变性。再用酸性缓冲液中和，质粒DNA由于分子较小，很快 复性，而染色体DNA分子巨大，几乎不能复性，最后和细胞碎片及膜蛋白共沉 淀被离心去除，上清液中含有复性的质粒DNA，蛋白质，RNA,并且盐浓度较 高。在这种条件下，质粒DNA能够牢固地结合在离心柱中的吸附基质上，而大 多数蛋白质和 RNA 在离心时被穿过，残留在吸附基质上的少量蛋白质和 RNA 可以用漂洗液洗去，最后，吸附在离心柱上的质粒DNA用低离子强度的溶液或 水洗脱。
与蛋白质相比， DNA 的分子量通常要大得多，必须用孔径较大的琼脂糖凝 胶介质进行分离。
在理想的电泳条件下，具有相同构型的DNA的电泳迁移率和它们分子量的 对数成线性关系，分子量相同的质粒DNA的电泳迁移率和它们的构型有关，由 快到慢通常为超螺旋，线性，开环和复制中间体（连环体）。
DNA 限制性内切酶可以从内部切割环状或线状双链 DNA，II 型 DNA 限制 性内切酶具有固定的识别位点和切割位点，它们可以在特定位点以特定方式切割 质粒DNA,并且产生有固定序列及形状的末端。因此，它们在重组DNA技术中 具有重要作用。
实验材料：
含质粒的大肠杆菌DH5a； LB+Amp培养基（配方参照《分子克隆》除非 特别说明，以下同）；柱离心质粒小量制备试剂盒（博大泰克公司）；质粒 DNA （PUC18-G）；电泳用琼脂糖；TAE缓冲液；goldview荧光染料；6x DNA上样 buffer；限制性内切酶 EcoRI （10 U/pl, G'AATTC）； Hindlll （10 U/pl, A'AGCTT）； 10x buffer R。
实验方法：
1．将带有质粒的大肠杆菌单克隆接种到 ml 含有相应抗生素的液体培养基,
37°C振荡培养12〜16小时；
ml过夜菌转移至Eppendorf管中，10000 rpm（ r/min）离心1 min,用水泵 吸干培养基上清液，加入100山溶液1（含RNaseA），充分混匀；
加入150山 溶液II，加盖颠倒6-7次使之混匀，室温放置1〜2min；
加入150卩l溶液III，加盖后颠倒6-7次混匀，室温放置5min；
用台式高速离心机， 12000 rpm 离心 10min；
吸附柱中加入 420 pl 结合缓冲液，将步骤5 中的上清转移至吸附柱中，盖上
收集管的盖子，混匀， 12000 rpm 离心 1 min；