文档介绍：优《血红蛋白的提取和分离》
（二）缓冲溶液
:
在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强
酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混
合溶液。
能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，
维持PH基本不变。
:放出血红蛋白
(3)分离血红蛋白溶液：
①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。
②试管中溶液层次：
第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；
第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；
第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；
第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。
③分离：
滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层，
分液漏斗中静置：分出下层的红色透明液体。
甲苯层（无色透明）
白色薄层固体
红色透明液体
杂质沉淀层（暗红色）
试管中溶液层次
(4)透 析：
①过程：
取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液中（），透析12h
②目的：
除去样品中分子量较小的杂质和离子。
或用于更换样品的缓冲液。
20mmol/L磷酸缓冲液
1mL
透析过程动画演示
:
（1）凝胶色谱柱的制作：
①取长40厘米，，两端磨平。
②底塞的制作：
打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。
③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。
④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。
⑤安装其他附属结构。
（2）凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择：
A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。
B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度
及分离范围。
75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨
。
②凝胶的前处理：
配置凝胶悬浮液：
计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中
充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。
③凝胶色谱柱的装填方法：
A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。
B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱
内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀
注意：
1、装填时尽量紧密：降低凝胶颗粒之间的空隙。
2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
④洗涤平衡：
连接缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/L的磷酸缓冲液（）充分洗涤平衡12h。
注意：
1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响分离效果
2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
（2）凝胶色谱柱的装填
50cm高
（3）样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：
打开下端出口，使缓冲液下降到与凝胶面平齐，关闭出口
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，
注意： 1、不要触及并破坏凝胶面。
2、贴壁加样
3、吸管管口贴着管壁环绕移动加样
③样品渗入凝胶床：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，
样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口
④洗脱：加入pH= 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，
连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出
液，每5ml收集一试管，连续收集。
（如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
（3）样品加入与洗脱
注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
思考下面的问题：
让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。
1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？
2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？
血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
血红蛋白提取和分离的程序包括：
样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
样品的处理：通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、
离心等操作收集