文档介绍：文件排版存档编号：[UYTR-OUPT28-KBNTL98-UYNN208]
目的基因的获取
目的基因的获取
目的基因的获取
基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高
2、意义
(1)使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来
(2)是分离克隆目的基因的主要途径
(3)复杂基因组作图的重要依据。
3、构建
基因文库构建的一般步骤:(1)细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备;(2)载体DNA的制备;(3)载体与外源大片段连接;(4)体外包装及基因组DNA文库的扩增;(5)重组DNA的筛选和鉴定。构建过程如下:
图1 基因组文库构建的概况
举例:
图2 采用λ噬菌体载体EMBL3A产生基因组DNA文库。高相对分子质量的基因组DNA由Sau3A I部分地消化。得到的片段用磷酸酶处理，以去除它们5’端的磷酸基团。载体由BamH I和EcoR I消化，它们在多位点接头内切割。微小的BamH I,EcoR I多位点接头的片段在异丙醇沉淀中除去，或者还可以通过预先的琼脂糖凝胶电泳纯化载体的臂。接着载体臂和经过部分消化的基因组DNA相连接。磷酸酶的处理可以防止基因组DN***段自相连接。非重组载体不能重新复原，因为那些小小的多位点接头片段已去除。仅有的装配分子则
+-是重组噬菌体。它们是作为Sup大肠杆菌的P2溶源菌的噬菌斑获得的。Spi筛选确保了缺
+乏red和gam基因的噬菌体的复原。Sup宿主是必要的，因为在这个例子中，载体在基因A和B上带有琥珀突变。这种突变增加了生物保守性，可以用于筛选的程序(比如重组筛选)，
+或Sup基因的DNA标记。最终，外源的DNA通过SalI位点从载体上切除[注意:Roger:等(1988)已经发现EMBL3多克隆为单序列并非完全像以前描述的那样。它包括一段特别的序列，上面有一个以前没有报告过的Pst I位点。但这不会影响到载体的大多数功能 4、基因组文库的大小
一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。
N:克隆数目
P:设定的概率值(如:0(99)
x:插入片段平均大小(15,20kb)
y:植物基因组大小(以kb计)
6如果插入片段平均大小为 20 kb 某植物基因组大小为 4 x 10bp，P=，根据上式
5N?1 ×10。
5含 1×10个克隆的基因文库相当覆盖了 5倍的基因组，在片段随机分布时，从文库中找到
。
(二)cDNA文库
1、概念
cDNA文库:利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细
菌细胞中进行保存和扩增。
2、cDNA文库的特点
(1)不含内含子序列。
(2)可以在细菌中直接表达。
(3)包含了所有编码蛋白质的基因。 (4)比DNA文库小的多，容易构建。 3、构建
cDNA文库构建共分四步:
细胞总RNA提取并分离纯化出mRNA; 合成cDNA第一链;
将mRNA,DNA杂交分子转变成双链cDNA;