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混合退火
根据目的基因全序列,分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段
T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
化学合成法的基本战略
全基因合成有三少需要45万个克隆;,基因文库至少需要180万个克隆
Date
19
For example :
,插入片断为20kb的 (×106 bp) 和 human (3×109 bp) 基因组的克隆数的计算
N = = ×103
ln( 1-)
ln[1-(2×104/×106)]
Nhuman= = ×105
ln(1-)
ln[1-(2 ×104/3 ×109)]
这个例子说明用质粒载体(插入片段5-10kb)就可以建立很好的原核生物基因文库,只需要几千个克隆;而真核生物则需要更大承载能力的载体。
Date
20
除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因文库应具备下列条件:
重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力
载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆
克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序
克隆片段易于从载体分子上完整卸下
重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
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第一节 目的基因的制备
①材料的选择及基因组DNA的制备;
②载体的选择;
③载体与基因组DNA的限制性酶切;
④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞;
⑤ 重组克隆的筛选和保存。
Date
22
基因组DNA的制备
A
A
A
A
文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。
制备的DNA分子量越大,经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低,重组率和完备性也就越高
用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左右。如果先将细胞固定在低融点凝胶中,然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡,可获得1000 kb大小的DNA片段
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第一节 目的基因的制备
载体的选择
出于压缩重组克隆的数量,用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒;对于大型基因组(如动植物和人类)需使用YAC或BAC载体。由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb,因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒。上述几种载体的最大装载量如下:
l-DNA
质粒
考斯质粒
10 kb
23 kb
45 kb
BAC
300 kb
用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌
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第一节 目的基因的制备
载体与基因组DNA的切割
用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法,其目的是:
第一 保证DNA片段之间存在部分重叠区。
第二 保证DNA片段大小均一。
超声波处理后的DNA片段呈平头末端,需加装人工接头。
部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶,这样DNA酶解片段的大小可控。
连接前,上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离,以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体。
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第一节 目的基因的制备
载体与外源片段的连接(1) 连接酶
DNA连接酶;T4 DNA连接酶; DNA连接酶
它们都可以催化5’末端磷酸和3’末端羟基形成磷酸二酯键。
但由于T4 DNA连接酶既能连接粘性末端还能连接平末端, DNA连接酶主要连接粘性末端,所以一般连接反应中都用T4 DNA连接酶。
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第一节 目的基因的制备
(2)连接反应的效率
连接反应的效率和连接产物的组成与DNA末端的特性、DNA末端的浓度以及所用的连接酶量有关。
平末端连接反应的效率相对较低,它需要较高浓度的平末端、较大的连接酶量、较低浓度的ATP以及不能有象亚精胺一类的多胺。
在连接反应中加入15%的PEG 8000或1~/L 氯化六氨合钴等浓缩剂可极大地促进平末端反应的连接速度,同时可改变不同连接产物的比例,使连接