文档介绍：蛋白质的结构
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两个肽平面以一个Cα为中心发生旋转
在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为多肽的氨基酸顺序。
通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。
测定蛋白质的一级结构的要求
蛋白质和多肽氨基酸顺序的测定
(1)、肽链的拆开和分离
(2)、测定蛋白质分子中多肽链的数目
(3)、二硫键的断裂
(4)、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比
(5)、N端、C端的测定
(6)、多肽链断裂
(7)、测定每个肽段的氨基酸顺序。
(8)、确定肽段在多肽链中的次序。
(9)、确定原多肽链中二硫键的位置。
酸水解
常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。
此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；
含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬(天冬)酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。
碱水解
一般用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。
由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。
部分的水解产物发生消旋化。
该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。
酶水解
目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。
应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。
测定步骤
(1) 多肽链的拆分。
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。
蛋白质一级结构的测定
测定步骤
几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).
蛋白质一级结构的测定
测定步骤
(2) 测定蛋白质分子中多肽链的数目。
通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
蛋白质一级结构的测定
测定步骤
(3) 二硫键的断裂
几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。
蛋白质一级结构的测定
二硫键的切割与保护
1、过甲酸〔performic acid〕 不可逆
－CH2SO3H
2、还原＋氧化 不可逆
[ 巯基乙醇，DTT ] ＋ 碘乙酸等
－S-CH2-COOH
3、亚硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆
－R1-S-S-R2 ＋ HSO3-
R1-S- + R2-S-SOH3
测定步骤
可以通过加入盐酸胍的方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。
蛋白质一级结构的测定
作用：这些反应可用于巯基的保护。
巯基（-SH）的保护
(4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；
蛋白质一级结构的测定
测定步骤
(5)分析多肽链的N-末端和C-末端。
蛋白质一级结构的测定
多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。
在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。
末端氨基酸测定
N末端：
1、Sanger法
2、Edman法
3、DNS-Cl
4、酶降解法
C末端：
1、肼解法
2、酶降解法
3、硼氢化锂法
Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。
在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。
末端氨基酸测定
① 二硝基氟苯（DNFB）法
Sanger试剂(DNFB)标记N末端
② Edman 降解法(I)
Edman 降解法(II)
氨基酸的鉴定、分离纯化
PTH-AA
在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。