文档介绍：Modified by JEEP on December 26th, 2020.
常规病毒学实验技术
常规病毒学实验技术
（一）病毒的培养
实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠
主要用于：
分离病支原体和病毒的污染。
细胞分散剂
胰酶 使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
乙二***四乙酸二钠（EDTA）
营养液
人工综合营养液
氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
血清
动物血清中含有细胞生长所必须的各种营养因子。
促进细胞的贴壁和生长。
具有很强的酸碱缓冲作用。
（二）病毒感染力的滴定
LD50，EID50，TCID50
（TCID50的测定）
在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1— 10-10。
将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种100ul。
3．然后在每孔加入细胞悬液100ul，使细胞量达到3×105个/ml。
4．设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
5．逐日观察并纪录结果，一般需要观察5-7天。
6．结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
TCID50的计算方法：
Reed-Muench法
病毒液
稀释度
出现
CPE孔
不出现CPE孔
累计
出现CPE孔 不出现CPE孔
出CPE的孔 所占的%
10-1
8
0
27
0
100（27/27）
10-2
8
0
19
0
100（19/19）
10-3
7
3
1
1
5
7
11
1
(11/12)
10-4
4
6
40（4/10）
10-5
1
13
（1/13）
10-6
0
8
0
21
0（0/21）
高于50%的百分数-50%
距离比例= = =
高于50%的百分数-低于50%的百分数
lgTCID50=距离此例X稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
=×(-1)+(-3)=
TCID50=
2. Karber法
病毒液稀释度 出现CPE孔的比率
10-1 8/8=1
10-2 8/8=1
10-3 7/8=
10-4 3/8=
10-5 1/8=
10-6 0/8=0
lgTCID50=L-d
L: 最高稀释度的对数
D：稀释度对数之间的差
S：阳性孔比率总和
lgTCID50=-1-（-1）× =
TCID50=
（三）病毒中和试验
一、原理
抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染能力。
二、用途
1. 疾病诊断。
2. 病毒分离株的鉴定。
3. 不同病毒株的抗原关系研究。
4. 疫苗免疫原性的评价。
5. 免疫血清的质量评价。
6. 测定实验动物血清中是否存在抗体等。
三、分类
（一）终点法中和试验
1. 固定病毒——稀释血清法。
1) 将测好TCID50的病毒稀释成200个TCID50的病毒悬液。
2) 在96孔微量培养板中将血清作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50ul生长液，再加50ul待检血清，混匀后，吸50ul至下一孔，如此下去。一直到1:256），每个稀释度作4孔。
3) 在上述各孔内加入50ul稀释好的病毒液，混匀后放入37℃ 5%CO2培养箱中作用45min-60min。
4) 同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照。
5) 感作完成后每孔加入100ul细胞悬液，放37℃ 5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。
6) 结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
Reed-Muench计算方法：
血清稀释度
CPE孔数
无CPE孔数
累 计
CPE孔数 无CPE孔数 保护率（%）
1:4（）
0
4
0
9
100
1:1