PCR技术分离目的基因.ppt

文档介绍：PCR技术分离目的基因
由NordriDesign提供

3 PCR反应体系的组成
1）DNA模板
2）引物
引物是指与待扩增的靶DNA两端序列互补的人工合成的寡聚核苷酸（15－30bp）PCR技术分离目的基因
由NordriDesign提供

3 PCR反应体系的组成
1）DNA模板
2）引物
引物是指与待扩增的靶DNA两端序列互补的人工合成的寡聚核苷酸（15－30bp）。
3）dNTPs
4）耐热性DNA聚合酶
5）反应缓冲液
PCR引物的设计原则:
 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。  寡核苷酸引物长度为15~30bp。
+C含量 G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。  引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
 两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
逆转录PCR (RT-PCR)
将mRNA逆转录与PCR技术相偶联的一种基因分离技术。
二 PCR技术分离目的基因
ＲＴ－ＰＣＲ
逆转录酶
ＤＮＡ聚合酶
mRNA
cDNA
杂化双链
PCR扩增
RACE（Rapid amplification of cDNA ends）
cDNA末端的快速扩增技术，是以mRNA为模板合成cDNA第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3’或5’端之间未知序列的方法。
3’-RACE
5’-RACE
思考题：
 
1 什么是PCR？PCR包括哪三个基本步骤，各步骤的反应温度有什么特点？
2 PCR反应体系有哪些重要组成成分？什么是引物？引物有哪两种类型？
3 什么是RACE？它包括了哪两种PCR反应？
目的基因的分离技术：
基因文库技术
PCR技术
插入突变法分离目的基因
图位克隆法分离目的基因（chromosome walking）
酵母双杂交技术分离目的基因
基因芯片技术
蛋白质组学技术
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第三节 基因的化学合成
在基因的化学合成中，首先要合成出有一定长度的、具有特定序列结构的寡核苷酸片段，然后再通过DNA连接酶的作用，使它们按照一定的顺序共价地连接起来。目前已发展出来的有关寡核苷酸片段的化学合成方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，以及在后二者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。
磷酸二酯法（最早创立的DNA化学合成方法）
基本原理：将两个在5’或3’—末端各带有适当保护基团的脱氧单核苷酸连接起来，形成一个两端都被保护的二核苷酸分子。然后此分子脱保护（除去一端的保护基团），再进行新的缩合反应。
Sanger双脱氧链终止法
利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F. Sanger等人于1977年发明的。
它的基本原理是，利用了DNA聚合酶所具有的两种酶催反应的特性：
第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA作模板，合成出准确的DNA互补链；
第二，DNA聚合酶能够利用2’，3’—双脱氧核苷三磷酸作底物，使之参入到寡核苷酸链的3’—末端，从而终止DNA链的生长。
第四节 DNA测序
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